通過(guò)融合雙親短肽改善L-天冬酰胺酶酶學(xué)特性

楊套偉，饒志明，賈明媚，張顯，徐美娟

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

通過(guò)融合雙親短肽改善L-天冬酰胺酶酶學(xué)特性

楊套偉，饒志明*，賈明媚，張顯，徐美娟

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

L-天冬酰胺酶可以將L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸與氨，主要應(yīng)用在醫(yī)藥與食品行業(yè)。作者嘗試在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自組雙親短肽，改善該酶的酶學(xué)特性。首先，利用分子克隆技術(shù)將6條分別具有不同特征的短肽與L-天冬酰胺酶的N-端融合，并在Escherichia coli BL21中進(jìn)行表達(dá)，最后，利用Ni2+-NTA純化獲得純的重組L-天冬酰胺酶酶液。結(jié)果表明，融合SAP4對(duì)L-天冬酰氨酶（ansZ酶）動(dòng)力學(xué)特征影響較大，融合蛋白SAP4-ansZ的比活力較融合前提高約30%，其中重組蛋白Km值較原始酶下降了7.5%，而Vmax值得提升了10%，說(shuō)明融合SAP4可以改善ansZ酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率。

L-天冬酰胺酶；雙親短肽；融合；酶學(xué)特征

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase amidohydrolase，E.C.3.5.1.1）能夠?qū)-天冬酰胺水解脫氨基形成L-天冬氨酸和氨［1］。1961年，Broome證明豚鼠血清可以有效抑制白血病細(xì)胞6C3HED［2］。目前，L-天冬酰胺酶已經(jīng)被制成藥劑，成為抗癌以及治療急性淋巴細(xì)胞白血病新藥之一，在日本以及歐美等國(guó)家均已有該商品酶出售［3］。另外，在食品加工前加入天冬酰胺酶可以有效降低丙烯酰胺含量。Kukurova等研究發(fā)現(xiàn)，在面粉高溫處理之前加入不同劑量的天冬酰胺酶，油炸食品中丙烯酰胺的含量較對(duì)照減少達(dá)90%，面粉中谷氨酸比未處理的樣品增加37%，而加工產(chǎn)品的顏色沒(méi)有明顯的變化［4］。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉凌等發(fā)現(xiàn)油炸膨化產(chǎn)生的丙烯酰胺含量比微波膨化多，加入一定劑量的L-天冬酰胺酶后，食品中95%以上的L-Asn都可以轉(zhuǎn)化成L-Asp，油炸膨化中丙烯酰胺含量可以減少45%，表明添加L-天冬酰胺酶可以從源頭上有效地抑制食品加工過(guò)程中丙烯酰胺的生成［5］。

從豚鼠血清中提取L-天冬酰胺酶，不但含量少，且提取工藝復(fù)雜；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-天冬酰胺酶具有周期短，提取成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，利用微生物法生產(chǎn)L-天冬酰胺酶研究較多的主要包括E.coli、E.carotovora以及E.chrysanthemi等，但是這些野生菌株酶活力較低，通過(guò)分子改造構(gòu)建高效合成L-天冬酰胺酶的重組菌是一個(gè)有效的手段之一。Sidoruk等通過(guò)將來(lái)源于Y.pseudotuberculosis Q66CJ2（YpA）的L-天冬酰胺酶在E.coli中異源表達(dá)，重組菌酶活可達(dá)到20 U/mL［6］。孫茂盛等將E.coli L-天冬酰胺酶II的β-轉(zhuǎn)角位置Asp178換成Pro，重組酶的熱穩(wěn)定性得到提高，半衰期溫度（T16/02min）由原58℃提高至63℃，而對(duì)酶催化活力以及米氏常數(shù)Km和Kcat無(wú)影響［7］。

通過(guò)化學(xué)或分子修飾能夠有效改善酶的特征［8-9］。自組雙親短肽（Self-assemblingamphipathic peptides，SAP）是由相互交替的親水性和疏水性氨基酸形成，能夠聚集形成有序的納米結(jié)構(gòu)［10］。因此，SAP主要應(yīng)用于納米技術(shù)領(lǐng)域。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SAP可以用于改善酶學(xué)特性：例如利用這些短肽形成的氫化作用來(lái)固定化酶以提高酶活和穩(wěn)定性［10］，通過(guò)融合雙親短肽提高脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性和比酶活［11］，融合雙親短肽同樣可以提高堿性淀粉酶的催化效率、熱穩(wěn)定性以及抗氧化性［12］，而融合雙親短肽對(duì)于對(duì)L-天冬酰胺酶還未見(jiàn)報(bào)道。

1　材料與方法

1.1多肽序列

連有6種不同的自組雙親短肽（SAP）的重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAPs由江南大學(xué)劉龍教授惠贈(zèng)，6個(gè)不同序列的多肽特征見(jiàn)表1［13］。位于短肽SAP的C端和ansZ N端之間有一段序列為PTPPTTPTPPTTPTPT的連接臂（PT linker），SAP、PT linker和ansZ基因連接至表達(dá)載體pET-22b（+）。

表1　多肽序列及特征Table 1 Sequences and characterisitics of the peptides

1.2N端融合多肽菌株的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAP-ansZ的構(gòu)建過(guò)程如下：首先以實(shí)驗(yàn)室保藏pMD18-T-ansZ［14］為模板擴(kuò)增ansZ基因。引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物：GACCCATGGATATGAAAAAACA ACGAATGC（Nco I）

下游引物：GACCTCGAGTTAATACTCATTGAA ATAAG（Xho I）

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后分別連接于同樣酶切的pET-22b（+）/SAP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b（+）/SAP-ansZ，重組表達(dá)載體通過(guò)CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli，獲得重組菌E.coli/pET-22b（+）/SAP-ansZ，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，采用甘油法保藏。

1.3重組酶的純化

按照E.coli培養(yǎng)方法，發(fā)酵結(jié)束后，4℃、8 000 g離心10 min，棄上清液，收集菌體并用PBS緩沖液洗滌2次，超聲波破碎菌體，4℃、10 000 g離心30 min，收集上清液并用0.45μm無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾。過(guò)濾液采用Ni2+-NTA純化，上樣至已用McAc-0溶液平衡的Ni2+親和吸附柱，用McAc-0洗去雜蛋白，目的蛋白采用0～1.0 mol/L的咪唑溶液進(jìn)行線性梯度洗脫洗脫，收集最大吸收峰處的洗脫液，用于SDSPAGE分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.4酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1重組酶的分離純化

1）硫酸銨分級(jí)沉淀：重組菌B.subtilis 168/ pMA5-ansZ于最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，于4℃、8 000 g離心10 min，收集上清液，低溫條件下向上清液中添加研碎的（NH4）2SO4粉末至6個(gè)不同飽和度（30%～80%），0℃靜置，4℃、10 000 g離心30 min，收集上清液，沉淀用含有1.5 mol/L（NH4）2SO4的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）溶解，分別測(cè)定上清液與沉淀的酶活。

2）疏水層析：重新溶解的沉淀采用0.45μm無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液上樣至Butyl Sepharose HP層析柱，用含1.5 mol/L（NH4）2SO4的Tris-HCl緩沖液清洗雜蛋白至基線平衡，目的蛋白用0～1.5mol/L的（NH4）2SO4緩沖液線性梯度洗脫，流速為1.0mL/min，收集目標(biāo)蛋白，透析袋透析去除鹽離子，透析后的蛋白用于SDS-PAGE分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.4.2重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1）Asn的最適反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度：將純酶液分別加入到不同pH緩沖液中（pH 3.0～6.5，0.05 mol/L citrate-sodium citrate buffer；pH 6.5～9.0，0.05 mol/L Tris-HCl buffer；pH 9.0～10.0，0.05 mol/L borax-sodium hydroxide buffer），于37℃反應(yīng)15 min，氨氣敏電極測(cè)定酶活，考察不同pH緩沖液對(duì)天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得重組酶的最適反應(yīng)pH。在最優(yōu)pH條件下，將純酶液添加到反應(yīng)體系中，將反應(yīng)體系分別置于20～70℃（每隔5℃為一個(gè)梯度）反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，分析不同反應(yīng)溫度對(duì)天冬酰胺酶催化反應(yīng)的影響，獲得此酶的最適反應(yīng)溫度。

2）Asn的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性：將該酶放置于不同pH緩沖液中，0℃保溫24 h，每隔一段時(shí)間取樣，測(cè)定酶活，考察ansZ在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性。將純酶液分別在-20、0、20、30、40、50、60℃放置10 h，每隔一段時(shí)間取樣，于最適反應(yīng)pH和溫度下反應(yīng)15 min，測(cè)定酶活，考察ansZ在不同溫度下的穩(wěn)定性。

3）Asn反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值和Vmax：配制不同濃度的L-Asn和L-Gln緩沖液，加入過(guò)量的純酶液，反應(yīng)體系置于最適條件下反應(yīng)，通過(guò)氨氣敏電極測(cè)定產(chǎn)物氨的增加量，通過(guò)Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算獲得Km值和Vmax。

1.5Asn的結(jié)構(gòu)模擬和分析

Asn的結(jié)構(gòu)采用EasyModeller2.0軟件模擬，以L-天冬酰胺酶1hg0B為模板，模擬出的3-D結(jié)構(gòu)采用Discovery studio 2.5軟件進(jìn)行分析。

1.6Asn酶活測(cè)定

酶活測(cè)定采用氨電極法，氨電極可以測(cè)定溶液中的溶解氨［15-16］。檢測(cè)設(shè)備包括連接至數(shù)顯pH計(jì)的氨氣敏電極和磁力攪拌器。25 mL反應(yīng)體系：10 mL、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，10 mL、0.05 mol/L L-Asn，加入0.5～1.0 mL的酶液，37℃水浴反應(yīng)15 min，加入5 mL、15%三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照管在水浴反應(yīng)之前加入5 mL、15%三氯乙酸。氨電極采用不同濃度的NH4Cl溶液校正并獲得銨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活單位：按照以上條件，單位體積酶催化L-天冬酰胺產(chǎn)生1μmol/L的氨所消耗的酶量為1個(gè)酶活單位。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法測(cè)定［17］。

1.7Asn酶純化指標(biāo)的計(jì)算

總活力=活力單位數(shù)/mL酶液×總體積（mL）

比活力（U/mg蛋白質(zhì)）=活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)=總活力單位數(shù)/mg總蛋白質(zhì)

純化倍數(shù)=第一次的比活力/每次的比活力

回收率（%）=第一次總活力/每次總活力×100%

2　結(jié)果與討論

2.1重組菌E.coli BL21/pET-22b（+）-SAP-ansZ的構(gòu)建

將表1所述的6條SAP分別與ansZ的N端接，多肽與ansZ之間采用PT linker連接。重組載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21，通過(guò)Amp抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，6條多肽菌連接至載體pET-22b（+），經(jīng)過(guò)Xho I和Nco I雙酶切后獲得1.1 kb和5.7 kb左右大小的線性化基因片段。

圖1　多肽融合重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖Fig.1　Identification of the recombinant plasm ids by enzyme d igestion

2.2重組蛋白的表達(dá)與純化

按照2.3方法，采用Ni2+-NTA進(jìn)行純化，獲得純酶液，對(duì)純酶液進(jìn)行酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析，融合蛋白的純化結(jié)果見(jiàn)表2。以不融合多肽的重組蛋白Asn作為對(duì)照，融合SAP5和SAP6，重組酶的比活力較對(duì)照有所下降，SAP6下降最明顯。融合SAP1對(duì)比酶活基本沒(méi)有影響，融合SAP2、SAP3和SAP4，重組蛋白的比酶活菌有所提高，其中SAP4-ansZ比酶活是對(duì)照的1.3倍。

純化蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖2，由電泳結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)Ni2+-NTA純化后，獲得單一的條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小約為38 000左右。

圖2　融合蛋白純化后SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of the purified fusion proteins

表2　融合蛋白的純化結(jié)果Table 2 Purification of the fusion proteins

2.3重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1重組蛋白的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性從圖3（a）可知，融合SAP1、SAP2、SAP5和SAP6的重組酶的最適pH沒(méi)有產(chǎn)生變化，最適pH值7.5，與不融合多肽的重組蛋白Asn相似，融合SAP3和SAP4的重組蛋白最適pH由7.5上升至8.0。由3（b）可知，融合多肽后，重組酶的pH穩(wěn)定性改變不明顯，融合蛋白穩(wěn)定性范圍與Asn較一致。

圖3　融合蛋白的最適pH（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.3　Effects of pH（a）and pH stability on the fusion p roteins（b）

2.3.2重組蛋白的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性由圖4（a）可知，融合蛋白的最適反應(yīng)溫度為37～40℃。融合SAP4和SAP5的重組酶最適反應(yīng)溫度與對(duì)照ansZ一致，均為40℃，融合SAP1、SAP2、SAP3和SAP6最適反應(yīng)溫度稍微下降，由40℃變?yōu)?7℃。圖4（b）為融合蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果。融合多肽后，重組酶的熱穩(wěn)定性較對(duì)照僅發(fā)生細(xì)微的變化，熱穩(wěn)定性范圍與對(duì)照較相似。

圖4　融合蛋白的最適溫度（a）及熱穩(wěn)定性（b）Fig.4　Effects of tem perature（a）and thermal stability on the fusion proteins（b）

2.3.3重組蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法求得融合蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，融合SAP1、SAP2、SAP3、SAP4和SAP6重組蛋白的米氏常數(shù)Km均下降，其中融合SAP1變化最大，Km值由0.68mmol/L下降為0.49 mmol/L，而融合SAP5酶的Km值有所上升，其Km值為0.75 mmol/L。只有融合SAP2和SAP4的重組蛋白最大反應(yīng)速率Vmax較對(duì)照有所增大，其中融合SAP4 Vmax由60.24μmol/（L·min）上升至66.22μmol/（L·min），其他多肽的融合均導(dǎo)致Vmax不同程度下降，SAP3下降最明顯，Vmax值僅為25.25 μmol/（L·min）。因此，融合SAP4對(duì)Asn酶動(dòng)力學(xué)特征影響較大，其中重組蛋白Km值較原始酶下降了7.5%，而Vmax值得提升了10%，說(shuō)明融合SAP4可以改善ansZ酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率。

表3　融合蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 3 Kinetic parameters of the fusion proteins

2.4重組蛋白結(jié)構(gòu)模擬與分析

由酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合SAP4的重組酶比活力較對(duì)照獲得提高，酶的催化效率獲得一定程度提高，底物親和力也有所提高。采用計(jì)算機(jī)模擬獲得了原始酶Asn和重組酶SAP4-ansZ的結(jié)構(gòu)，和其他已報(bào)道結(jié)構(gòu)的L-天冬酰胺酶一樣，該酶是一個(gè)四聚體復(fù)合物，含有四個(gè)亞基［18］，每個(gè)亞基含有14個(gè)β折疊和8個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。為了便于觀察，我們將連接多肽的亞基結(jié)構(gòu)單獨(dú)顯示出來(lái)，見(jiàn)圖5，并探討短肽的加入對(duì)其活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的影響。L-天冬酰胺酶N端的活性位點(diǎn)包括Thr 36、Ser 84、Glu 87、Thr 109、Asp 112和Ala 148，除了Ser 84和Glu 87位點(diǎn)外，其它氨基酸殘基都是非常保守的［18-19］。在催化反應(yīng)過(guò)程中親核試劑主要為T(mén)hr殘基，酶活性中心的Thr殘基上的羥基親核攻擊底物β-羰基上的C原子，形成四面體中間構(gòu)型［18］。

圖5　Asn（a）和SAP4-ansZ（b）的3-D結(jié)構(gòu)Fig.5 3-D structure of Asn（a）and SAP4-ansZ（b）

圖6為酶的活性位點(diǎn)分析結(jié)果，SAP4-ansZ的活性位點(diǎn)與Asn相比較，構(gòu)象有細(xì)微的改變，而且融合后活性位點(diǎn)周?chē)臍滏I數(shù)及鹽離子鍵也減少，氫鍵和離子鍵的減少會(huì)使活性位點(diǎn)之間的催化殘基變得更靈活。因此，氫鍵和離子鍵的改變可能會(huì)使酶的催化效率及對(duì)底物親和力提高［20］。

圖6　Asn（a）和SAP4-ansZ（b）的活性位點(diǎn)分析Fig.6 Analysis of the active site of Asn（a）and SAP4-ansZ（b）

3　結(jié)語(yǔ)

作者通過(guò)融合SAP4雙系短肽改善L-天冬酰氨酶對(duì)L-天冬酰胺的水解效率，而對(duì)該酶其它特征影響并不明顯。另外，該方法對(duì)于改善其它酶的特征提供了借鑒。

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Improvement of Characteristic of L-Asparaginase through Fusing Six Self-Assembling Amphipathic Peptides to Its N-Terminal

YANG Taowei，RAO Zhiming*，JIA Mingmei，ZHANG Xian，XU Meijuan
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

L-asparaginase（Asn）can catalyzes the hydrolysisof L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia.It ismainly applied in pharmaceutical and food industry.In this study，to improve the characteristic of Asn，we fused six self-assembling amphipathic peptides（SAPs）to its N-term inal and expressed the recombinant Asns in E.coli，respectively.Compared to w ide-type Asn，the SAP4-Asn activity increased by 30%，the value of Kmdecreased by 7.5%and the Vmaxincreased by 10%.The reaction kinetics analysis showed that the affinity ability and catalytic efficiency of the fusion enzyme towards L-asparagine improved compared to wide-type Asn.

L-asparaginase，self-assembling amphipathic peptides，fusion，characterization

Q 55

A

1673—1689（2015）11—1178—07

2014-05-20

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2015AA021004）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400082）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP11545）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；111引智計(jì)劃（111-2-06）項(xiàng)目；江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目。

楊套偉（1983—），男，河南漯河人，工學(xué)博士，講師，主要從事代謝工程、酶工程方面的研究。E-mail：ytw1228@163.com

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事代謝工程、發(fā)酵工程方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn