營養(yǎng)因子強化麥角硫因生物合成的研究

梅保良，劉琦，姜文俠，*，張維亞，楊萍

（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津300308）

營養(yǎng)因子強化麥角硫因生物合成的研究

梅保良1，2，劉琦2，姜文俠2，*，張維亞1，2，楊萍2

（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津300308）

以糙皮側(cè)耳CGMCC 6232菌絲體深層發(fā)酵制備麥角硫因，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類及濃度的無機鹽、維生素、生長調(diào)節(jié)劑、有機酸、氨基酸等營養(yǎng)因子，考察對麥角硫因合成積累的影響，研究可能的前體氨基酸對麥角硫因生物合成的影響規(guī)律。結(jié)果表明：添加氯化銨、硝酸銨、葉酸、VB1、吲哚丁酸、丙酮酸、檸檬酸、谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸和甜菜堿對麥角硫因的合成有一定的促進作用，其中以發(fā)酵第4天向發(fā)酵液中添加15 mmol/L蛋氨酸最利于麥角硫因的合成，發(fā)酵液中麥角硫因的含量達192.4 mg/L，比對照組（102 mg/L）提高了88.6%。

麥角硫因；生物合成；發(fā)酵強化；營養(yǎng)因子；糙皮側(cè)耳

麥角硫因（L-Ergothioneine，EGT）是一種結(jié)構(gòu)及功能獨特的天然稀有手性氨基酸，是一種多功能的細胞生理保護劑［1］，在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。利用食用菌深層發(fā)酵制備麥角硫因，具有生產(chǎn)成本低、可通過代謝調(diào)控等技術(shù)手段提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢，更能夠保證產(chǎn)品的安全性，是合成麥角硫因的發(fā)展方向［2］。

目前對蕈菌合成麥角硫因的發(fā)酵優(yōu)化研究多限于碳源、氮源和常量營養(yǎng)元素的篩選以及發(fā)酵過程的工藝優(yōu)化［2-5］。麥角硫因是次生代謝產(chǎn)物，前體、維生素、生長調(diào)節(jié)劑、氨基酸等常常是次級代謝物生物合成的重要營養(yǎng)和調(diào)節(jié)因子。本文基于對食用菌生物合成麥角硫因途徑的推測及對食用菌菌絲體發(fā)酵過程的認識，考察了多種營養(yǎng)因子和可能的合成前體對麥角硫因合成積累的影響，強化麥角硫因的發(fā)酵積累過程。

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

菌種：糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）CGMCC 6232。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉30.0，豆粕粉15.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，α-淀粉酶80 U/L，自然pH，500 mL三角瓶裝液量為150 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：甘油50.0，胰酪胨35.0，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，pH 5.6，500 mL三角瓶裝液量為150 mL，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與主要試劑

IS-RDV3型臥式恒溫振蕩器：美國精騏有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀：Agilent Technologies；TW-20型恒溫水浴鍋：Julabo公司；WH240型磁力攪拌器：WIGGENS公司；SW-OJ-2F型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；S20K型臺式pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16M型臺式冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Mill-Q型純水機、3 ku超濾離心管：Millipore公司；麥角硫因?qū)φ掌罚築iomol International Inc；甲醇（色譜純）：Merck公司；一水甜菜堿：濰坊祥維斯化學(xué)品有限公司。

1.3方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵方法

挑取CGMCC 6232斜面菌種約1 cm2，接種至種子培養(yǎng)基，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)96 h，制備種子液。將種子液按體積比5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)，制備菌絲體發(fā)酵液。

1.3.2麥角硫因的定量檢測方法

1.3.2.1樣品的預(yù)處理

菌絲體深層發(fā)酵結(jié)束，將菌絲體發(fā)酵液置于90℃水浴，200 r/min攪拌浸提15 min，麥角硫因浸提到細胞外的發(fā)酵液中。過濾，收集濾液置于截留分子量3 ku的超濾離心管，10 000 r/min離心超濾10 min，透過液即為發(fā)酵液中麥角硫因含量檢測的待測樣。

1.3.2.2HPLC定量檢測條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），兩根色譜柱串聯(lián)；流動相：甲醇-水溶液（體積比為1∶99），使用20%的乙酸調(diào)節(jié)流動相pH至5.0；檢測波長：257 nm；流速：0.7 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：5 μL。

2結(jié)果與分析

2.1無機鹽對麥角硫因生物合成的影響

分別向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.125 g/L硝酸銅、0.1 g/L硼砂、0.05 g/L硫酸銅、0.005 g/L硫酸亞鐵、0.05 g/L硫酸錳、0.1 g/L氯化鈣、0.025 g/L硫代硫酸鈉、2 g/L氯化銨、5 g/L硫酸銨、2.5 g/L硝酸銨、2 g/L碳酸銨和2 g/L磷酸銨，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察上述無機鹽對麥角硫因合成的影響。以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組，將對照組發(fā)酵液中麥角硫因的含量設(shè)定為100%，結(jié)果見圖1。

圖1　無機鹽對合成麥角硫因的影響Fig.1Effects of inorganic salts on EGT production

由圖1可見，添加氯化銨和硝酸銨提高了麥角硫因的合成。進一步優(yōu)化了這兩種銨鹽的添加濃度，氯化銨和硝酸銨的添加量分別為4 g/L和5 g/L時，發(fā)酵液中麥角硫因的含量較對照組提高24.4%和18.5%。試驗結(jié)果表明，酪蛋白胨與氯化銨或硝酸銨聯(lián)合使用更利于菌絲體中麥角硫因的合成積累。

2.2維生素對麥角硫因生物合成的影響

分別向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2.56 mg/L葉酸、0.02 mg/L生物素、6.25 mg/L VC、50 mg/L VB1、20 mg/L VB2、4 mg/L VB6和3 mg/L VB12，發(fā)酵培養(yǎng)14 d考察上述維生素對麥角硫因合成的影響。以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組，將對照組發(fā)酵液中麥角硫因的含量定為100%，結(jié)果見圖2。

圖2　維生素對合成麥角硫因的影響Fig.2Effects of vitamins on EGT production

維生素是許多蕈菌的重要生長因子，許多維生素作為輔酶或輔基的組成成分參與微生物的生長代謝［6］。從圖2得知，添加葉酸和VB1有利于麥角硫因的合成積累，進一步優(yōu)化兩種維生素的添加濃度，葉酸和VB1的添加量分別為0.64 mg/L和0.1 g/L，發(fā)酵液中麥角硫因的含量較對照組提高25%和11.1%。

2.3生長調(diào)節(jié)劑對麥角硫因生物合成的影響

生長調(diào)節(jié)劑是用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類物質(zhì)，可調(diào)控植物體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和酶的合成，對植物生長的不同階段起到調(diào)節(jié)的作用。近年來植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用領(lǐng)域愈加廣泛，在食用菌中的應(yīng)用也日趨擴大［7］。

分別向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加100mg/L肌醇、1mg/L赤霉素、5 mg/L吲哚乙酸、2 mg/L吲哚丁酸、1 mg/L脫落酸、5 mg/L激動素、5 mg/L奈乙酸和5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察對麥角硫因合成的影響。以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組，將對照組發(fā)酵液中麥角硫因的含量定為100%，結(jié)果見圖3。

圖3　生長調(diào)節(jié)劑對合成麥角硫因的影響Fig.3Effects of growth regulators on EGT production

上述生長調(diào)節(jié)劑中吲哚丁酸對麥角硫因的合成積累具有正向影響。進一步優(yōu)化了吲哚丁酸的添加量，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1 mg/L吲哚丁酸，發(fā)酵液中麥角硫因的含量較對照組提高9.32%。吲哚丁酸是一種內(nèi)源生長素，具有促進細胞分裂和生長的作用。陳都珍等使用木屑培養(yǎng)基對平菇進行固體發(fā)酵，考察了不同種類的生長調(diào)節(jié)劑對平菇菌絲體生長的影響，發(fā)現(xiàn)外源添加1 mg/L的吲哚丁酸提高菌絲體增長率7%～10%［8］。

2.4有機酸對麥角硫因生物合成的影響

分別向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5 mg/L乳酸、2.7 g/L丙二酸、1.76 g/L丙酮酸和0.2 g/L檸檬酸，以2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.6，發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察有機酸對麥角硫因合成的影響。以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組，將對照組發(fā)酵液中麥角硫因的含量定為100%，結(jié)果見圖4。

圖4　有機酸對合成麥角硫因的影響Fig.4Effects of organic acids on EGT production

由圖4看出，添加丙酮酸和檸檬酸有利于麥角硫因的合成積累。進一步優(yōu)化了兩種有機酸的添加濃度，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加2.2 g/L丙酮酸和0.4 g/L檸檬酸，發(fā)酵液中麥角硫因的含量比對照組提高了5.85%和10.4%。丙酮酸和檸檬酸是三羧酸循環(huán)的起始物和重要的中間產(chǎn)物，三羧酸循環(huán)是生物體內(nèi)糖、脂類和氨基酸代謝的共同途徑，許多合成代謝均利用三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物作為生物合成的前體來源［9］。

2.5氨基酸對麥角硫因生物合成的影響

Donald B.Melville等［10］利用同位素示蹤法驗證了麥角硫因在粗糙鏈孢霉中的合成前體為組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸，麥角硫因分子中的咪唑環(huán)和側(cè)鏈來源于組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸則是甲基供體和巰基供體，生物合成順序為組氨酸先經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用生成組氨酸甜菜堿，再經(jīng)半胱氨酸巰基化合成麥角硫因［11］。然而，至今麥角硫因在蕈菌中的生物合成途徑尚不清楚。為此，本研究向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和組氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)15 d，考查上述氨基酸對菌絲體合成麥角硫因的影響，結(jié)果見圖5～圖8。

圖5　外源谷氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.5Effects of glutamic acid supplementation on EGT production

圖6　外源蛋氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.6Effects of methionine supplementation on EGT production

圖7　外源半胱氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.7Effects of cysteine supplementation on EGT production

圖8　外源組氨酸對合成麥角硫因的影響Fig.8Effects of histidine supplementation on EGT production

谷氨酸是生物機體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，本試驗中谷氨酸的添加量為10 μmol/L時，發(fā)酵液中麥角硫因的最高含量達131mg/L，較對照組提高9.1%。

由圖6和圖7得知，分別向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1 mmol/L～20 mmol/L的蛋氨酸和半胱氨酸，發(fā)酵液中麥角硫因的含量均高于對照組。蛋氨酸和半胱氨酸的添加量為15 mmol/L，發(fā)酵液中麥角硫因的含量最高，分別達到179.6 mg/L和175.5 mg/L，較對照組提高49.5%和46%。試驗結(jié)果表明，兩種外源氨基酸的添加有效地促進了CGMCC 6232菌絲體發(fā)酵過程中麥角硫因的合成積累，推測蛋氨酸和半胱氨酸可能是CGMCC 6232合成麥角硫因的前體。

由圖8看出，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5 mmol/L～12 mmmol/L的組氨酸，麥角硫因的發(fā)酵水平隨組氨酸含量的增加呈下降趨勢，添加量為1 mmol/L，發(fā)酵液中麥角硫因的最高含量達129.5 mg/L，較對照組提高7.7%，組氨酸添加量超過4 mmol/L，麥角硫因的發(fā)酵水平卻低于對照組。推測外源組氨酸的添加可能抑制了內(nèi)源組氨酸合成麥角硫因的途徑，與DonaldB.Melville的研究結(jié)果一致：向粗糙鏈孢霉培養(yǎng)基添加外源組氨酸，內(nèi)源組氨酸合成麥角硫因的途徑即被抑制［11］。

2.6甜菜堿對麥角硫因生物合成的影響

1個甜菜堿分子中有3個非穩(wěn)態(tài)甲基，是有效的甲基供體，麥角硫因分子中含有甜菜堿的結(jié)構(gòu)，因此，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1 mmol/L～200 mmol/L的甜菜堿，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.6，發(fā)酵培養(yǎng)15 d，考察添加甜菜堿對合成麥角硫因的影響，結(jié)果見圖9。

圖9　甜菜堿對合成麥角硫因的影響Fig.9Effects of betaine on EGT production

隨甜菜堿添加量的增加，發(fā)酵液中麥角硫因的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，添加量為150 mmol/L時，麥角硫因的最高發(fā)酵水平達146.6 mg/L，較對照組提高了21.8%。

2.7氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響

Chih-Hung Liang等利用杏鮑菇菌絲體發(fā)酵合成麥角硫因，發(fā)現(xiàn)外源氨基酸的添加時間對麥角硫因合成的影響較大，分別在發(fā)酵起始和發(fā)酵第7天向培養(yǎng)基中添加4 mmol/L組氨酸，菌絲體中麥角硫因的含量較對照組（2.28 mg/g DW）提高了51.8%和72.4%［12］。本試驗考察了蛋氨酸和半胱氨酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響，分別在發(fā)酵起始、第2天、第4天、第6天和第8天向培養(yǎng)基添加15 mmol/L蛋氨酸和15 mmol/L半胱氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)15 d，測定發(fā)酵液中麥角硫因的含量，結(jié)果見圖10。

圖10　氨基酸的添加時間對合成麥角硫因的影響Fig.10Effects of amino acids supplementation at various days on EGT production

兩種氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的影響不同。在發(fā)酵第4天添加蛋氨酸，發(fā)酵液中麥角硫因的含量達192.4 mg/L，較對照組（102 mg/L）提高了88.6%。在發(fā)酵第6天添加半胱氨酸，發(fā)酵液中麥角硫因含量達168.5 mg/L，比對照組（114.4 mg/L）提高47.3%。由于麥角硫因是次生代謝產(chǎn)物，主要在發(fā)酵的中后期合成積累，在發(fā)酵中期添加蛋氨酸和半胱氨酸更利于麥角硫因的合成。

3結(jié)論

通過考察無機鹽、維生素、生長調(diào)節(jié)劑、有機酸、氨基酸和甜菜堿等營養(yǎng)因子對CGMCC 6232菌絲體深層發(fā)酵合成麥角硫因的影響，篩選到了12種促進麥角硫因合成積累的化合物，強化了麥角硫因的發(fā)酵積累過程。進一步考察了外源氨基酸的添加時間對麥角硫因合成積累的強化效果，在發(fā)酵第4天添加15 mmol/L的蛋氨酸，發(fā)酵液中麥角硫因的積累量最高，達192.4 mg/L，比對照組的102 mg/L提高了88.6%。

Donald B.Melville等［10］實驗確定了蛋氨酸和半胱氨酸是麥角硫因在粗糙鏈孢霉中的合成前體，本文試驗證明了蛋氨酸和半胱氨酸可以大幅度提高糙皮側(cè)耳合成積累麥角硫因，但還不能確定蕈菌中麥角硫因的合成代謝途徑是否與粗糙鏈孢霉中的合成途徑相同。因此，有必要深入探究蕈菌合成麥角硫因的前體，解析麥角硫因在蕈菌中的生物合成途徑，建立基于代謝調(diào)控的發(fā)酵過程優(yōu)化控制策略，進一步提高麥角硫因的發(fā)酵水平。

［1］劉琦，周濤，姜文俠.麥角硫因的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能［C］.氨基酸、有機酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇論文集，2012:234-242

［2］Pramvadee TepwongAnupam Giri，F(xiàn)umito SasakiRikuo Fukui，Toshiaki Ohshima.Mycobial enhancement of ergothioneine by submerged cultivation of edible mushroom mycelia and its application as an antioxidative compound［J］.Food chemistry，2012，131（1）:247-258

［3］劉琦，張維亞，姜文俠，等.麥角硫因生物合成技術(shù)的研究進展［C］. 2013年國際氨基酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇論文集，2013:22-27

［4］Republic KR Forestry Res Inst.Culture medium of Ganoderma neojaponicum for increasing ergothioneine and culture method of Ganoderma neo-japonicum［P］.KR:KR20100025825A.2008-08-28

［5］Lee Wi Young，Park Eung-Jun，Ahn Jin Kwon.Supplementation of methionine enhanced the ergothioneine accumulation in the Ganoderma neo-japonicum mycelia［J］.Applied biochemistry and biotechnology，2009，158（1）:213-221

［6］任桂梅，周茂林，毋楠，等.維生素B1對幾種擔(dān)子菌菌絲體生長的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（26）:8075-8076

［7］吳秀珍，王秋玲，杜雙田.無機鹽、維生素及生長調(diào)節(jié)劑對斑玉蕈菌絲生長的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，40（3）:158-162

［8］陳都珍，鄧世瑜，蔣紀(jì)英，等.生長激素對平菇產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.中國食用菌，1982（2）:28-35

［9］王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學(xué)（下冊）［M］.北京:高等教育出版社，2002:110

［10］MELVILLE D B，EICH S，LUDWIG M L.The biosynthesis of ergothioneine［J］.The Journal of biological chemistry，1957，224（2）: 871-877

［11］Askari A，Melville D B.Reaction sequence in ergothioneine biosynthesis-hercynine as an intermediat［J］.Journal of biological chemistry，1962，237（5）:1615-1618

［12］Liang Chih-Hung，Huang Ling-Yi，Ho Kung-Jui，et al.Submerged cultivation of mycelium with high ergothioneine content from the culinary-medicinal king oyster mushroom Pleurotus eryngii（higher basidiomycetes）anditscomposition［J］.Internationaljournalofmedicinal mushrooms，2013，15（2）:153-164

Study on the Biosynthesis of L-ergothioneine by Enhancement of Nutritional Factors

MEI Bao-liang1，2，LIU Qi2，JIANG Wen-xia2，*，ZHANG Wei-ya1，2，YANG Ping2
（1.Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

The mycelium of Pleurtus ostreatus CGMCC 6232 was used to produce L-ergothioneine by sub-merged fermentation in this study，the effect of adding different kinds and concentrations of inorganic salts，vitamins，growth regulators，organic acids and amino acids to culture medium on the production of EGT were investigated，particularly，the influencing rules of probable precursors on EGT biosynthesis was studied.The results showed that ammonium chloride，ammonium nitrate，folic acid，VB1，indolebutyric acid，pyruvic acid，citric acid，glutamic acid，methionine，cysteine，histidine and betaine improved EGT production，the effect of methionine on increasing EGT production was the most significant，the individual supplementation of 15 mmol/L methionine at the 4th day yielded a significantly 88.6%higher content of EGT in fermentation liquid（192.4mg/L）compared to that of the control medium（102 mg/L）.

L-ergothioneine；biosynthesis；enhancement of fermentation；nutritional factors；Pleurotus ostreatus

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.027

2014-03-27

天津市青年基金（13JCQNJC10100）；天津市科技支撐計劃重點項目（10ZCKFSY06300）

梅保良（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程（發(fā)酵）。