二氫辣椒堿標準樣品的研制

陳靜嫻，王岱杰，周曉晶，牟玉柱，李強，耿巖玲，于金倩，王曉

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省分析測試中心，山東濟南250014；3.北京理化分析測試中心，北京100089；4.煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺264000）

二氫辣椒堿標準樣品的研制

陳靜嫻1，2，王岱杰2，*，周曉晶3，牟玉柱4，李強2，耿巖玲2，于金倩2，王曉2，*

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省分析測試中心，山東濟南250014；3.北京理化分析測試中心，北京100089；4.煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東煙臺264000）

建立了二氫辣椒堿標準樣品的研制方法。采用催化氫化還原辣椒堿提取物和重結(jié)晶的方法制備二氫辣椒堿，UV、IR、MS和NMR等方法對二氫辣椒堿結(jié)構(gòu)鑒定，并進行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗，經(jīng)國內(nèi)8個具有分析資質(zhì)的實驗室進行協(xié)同定值，二氫辣椒堿標準樣品的標準值為99.30%，置信度95%的不確定度值為0.32%。所制得二氫辣椒堿標準樣品達到國家標準樣品的技術(shù)要求，可用于有關(guān)二氫辣椒堿檢測方法的校正和相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

二氫辣椒堿；標準樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值；不確定度

辣椒是我國藥典收錄藥材，為茄科植物辣椒Capsicum annuum L.或其栽培變種的干燥成熟果實，溫中散寒，開胃消食，用于寒滯腹痛，嘔吐，瀉痢，凍瘡等病癥［1］。辣椒也是全世界消費量最大的調(diào)味品和蔬菜之一，隨著辣椒的精深加工，其產(chǎn)品逐步成為重要的天然色素、制藥原料和其它工業(yè)原料。辣椒中辛辣味物質(zhì)主要是辣椒堿類化合物，為一類含酚羥基生物堿，主要包括辣椒堿、二氫辣椒堿、降二氫辣椒堿等化合物。研究表明辣椒堿類化合物具有長效鎮(zhèn)痛，抗菌消炎的作用［2-3］，對牛皮癬、禿發(fā)、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、牛皮癬、皮膚搔癢癥，糖尿病性神經(jīng)痛等癥狀具有明顯的治療效果［4-8］。二氫辣椒堿（結(jié)構(gòu)式見圖1）是藥典中規(guī)定辣椒的檢測指標，截至目前，我國尚無二氫辣椒堿標準樣品，市售二氫辣椒堿對照品純度也參差不齊。因此，為了滿足藥材及成藥分析檢測及質(zhì)量控制工作的需求，保證檢測結(jié)果的準確性、可比性和溯源性，急需制備二氫辣椒堿標準樣品。

圖1　二氫辣椒堿的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1The chemical structure of dihydrocapsaicin

1材料與方法

1.1材料

HPLC用甲醇為色譜純：山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；10%Pd/C：阿拉丁試劑有限公司；乙醇、乙醚、正戊烷、鹽酸等均為分析純：天津市廣成化學試劑有限公司；水為去離子水；天然辣椒總堿提取物：吉安市國光香料廠，辣椒堿含量66%，二氫辣椒堿含量30%。

1.2儀器

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6520 Q-ToF液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；WRS-1B數(shù)字熔點儀：上海精密科學儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計：日本島津公司；INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀：美國Varian公司；Vario EL III全自動元素分析儀：德國ELEMENTAR公司。

1.3方法

1.3.1催化合成二氫辣椒堿

將天然辣椒總堿提取物（1.0 g）溶于150 mL乙醇，氮氣保護下加入10%Pd/C（250 mg），在室溫下通入氫氣還原4 h。反應結(jié)束后過濾除去催化劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾至干，粗產(chǎn)物用正戊烷重結(jié)晶得二氫辣椒堿，收率89%。

1.3.2純度分析方法

采用等度HPLC、梯度HPLC、薄層色譜、HPLCMS等多種方法對所制備的二氫辣椒堿樣品進行純度檢驗，條件如下：

等度HPLC分析條件：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇/水=72/28；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運行時間：30 min；檢測波長：280 nm。

梯度HPLC分析條件：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：A為甲醇，B為水；梯度調(diào)：0～20 min，72%A，20 min～40 min，72%A～100%A，40 min～50 min， 100%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運行時間：50 min；檢測波長：280 nm。

薄層色譜條件：正己烷/乙酸乙酯（2/1）和正己烷/乙酸乙酯/甲醇（4/1/0.5），熒光檢測。

MS條件如下：ESI電噴霧離子源，毛細管電壓4.0 kV，載氣：普氮，載氣流速：10L/min，載氣溫度：300℃，掃描范圍為m/z=100～1 000。

1.3.3結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV、IR、MS和NMR等方法對二氫辣椒堿進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.4均勻性檢驗

按照GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35：2006《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法（7均勻性研究）》要求，采用的是隨機順序重復測量的方法，從分裝后的樣品中隨機抽取10瓶樣品（＞，按3種程序（第一次：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第二次：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第三次：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9）分別從每瓶中稱取0.2 mg樣品3份，每份樣品分別用1.0 mL色譜甲醇溶解，按1.3.2等度HPLC分析，以面積百分比讀取樣品的純度值。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進行分析，以判斷標準樣品的均勻性是否合格。

1.3.5穩(wěn)定性檢驗

二氫辣椒堿樣品于2℃～8℃保存，以兩年為期，采用對制備的二氫辣椒堿樣品每6個月取樣檢驗，按1.3.2等度HPLC分析，以面積百分比讀取樣品的純度值，每份試樣以測定5次的平均值為其定值結(jié)果，用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析［9］。

1.3.6定值

按照標準樣品工作導則，采用多個實驗室協(xié)作試驗定值，參加實驗室的數(shù)目為8個［9-12］。隨機抽取24瓶樣品，每個定值實驗室送3瓶，每瓶平行測定2次。定值實驗室將樣品配成一定濃度的溶液，高效液相色譜儀測定，采用峰面積歸一化法進行純度定值。

2結(jié)果與討論

2.1合成路線的設計

二氫辣椒堿分離主要采用硅膠柱色譜、制備液相色譜、高速逆流色譜等方法［13-15］，分離過程中存在制備量小、步驟繁瑣、溶劑消耗量大等缺點。二氫辣椒堿的傳統(tǒng)合成方法一般是由香草醛為起始原料，首先經(jīng)過多步反應制得辣椒堿，辣椒堿在催化劑下進行催化還原，最終制得二氫辣椒堿［16］。該法路線較長，反應條件苛刻，后處理繁瑣，收率較低。對辣椒提取物進行高效液相色譜分析時發(fā)現(xiàn)，天然辣椒總堿提取物主要成分為辣椒堿和二氫辣椒堿，其中辣椒堿占66%，二氫辣椒堿占30%。二氫辣椒堿與辣椒堿在化學結(jié)構(gòu)上的區(qū)別僅為雙鍵部分，因此，我們設計將辣椒提取物進行催化氫化還原，其中的辣椒堿被還原后總成分即變成二氫辣椒堿。如圖2所示。

圖2　二氫辣椒堿制備工藝路線Fig.2The preparation process of dihydrocapsaicin

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

表1　二氫辣椒堿的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑CDCl3）Table 1The1H-NMR data of dihydrocapsaicin（CDCl3）

2.2均勻性檢驗

均勻性是標準樣品最基本的屬性，它是用來描述標準樣品空間分布特征的。其定義是：以相同的結(jié)構(gòu)或成分存在，并具有一種或多種性能的物料的一種狀態(tài)。對具有一定規(guī)格的樣品，不論此標準樣品是否取自同一包裝（如瓶、包），通過檢驗，其被測定特性值都落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，就該標準樣品的這一特性而言稱為均勻。

表2　二氫辣椒堿的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑CDCl3）Table 2The13C-NMR data of dihydrocapsaicin（CDCl3）

以F檢驗，確定二氫辣椒堿標準樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否附合正態(tài)分布。其結(jié)果如下表3、表4、表5。

表3　均勻性檢驗測量數(shù)據(jù)Table 3Data of homogeneity test %

重復性標準偏差可由MSwithin計算：

表4　每瓶的平均值、方差和測量次數(shù)Table 4The mean，variance and time of measurement in each bottle

表5　均勻性研究的方差分析表Table 5The analysis of variance in homogeneity test

均勻性檢驗的不確定度Ubb=sbb=0.005

從上表可見，以υ1（即組間）=9及υ2（即組內(nèi)）=20，查F界值表，得F0.05（9，20）=2.94，由于F=MS間/MS內(nèi)= 1.19＜F0.05（9，20），所以本樣品是均勻的。

2.3穩(wěn)定性檢驗

標準樣品在規(guī)定的條件下儲存，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，其描述的性能數(shù)值應保持在規(guī)定的限量范圍內(nèi)。標準樣品的穩(wěn)定性是用來描述標準樣品的特性值隨時間變化的。

表6　穩(wěn)定性檢驗測量數(shù)據(jù)Table 6Data of stability test

從上表數(shù)據(jù)看，每次測得的平均值在測定時間內(nèi)沒有隨時間的變化而明顯的升高或降低，按計算，測定值應在且均在99.41%±0.13%內(nèi)，該樣品在兩年內(nèi)是穩(wěn)定的。

用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，二氫辣椒堿標準樣品隨時間變化而均勻發(fā)生變化，采用直線作為經(jīng)驗模型，觀察斜率值是否有顯著變化對標準樣品的穩(wěn)定性變化進行預測，為此做了如下數(shù)理處理：

斜率可以用下式計算：

截距由下式計算：

直線上的點的標準偏差可由下式計算：

取其平方根s=0.051，與斜率相關(guān)的不確定度用下式計算：

自由度為n-2和p=0.95（95%置信水平）的分布t因子等于3.182

由于：

即：|b1|＜0.008 6

所以，斜率的變化不顯著。因而二氫辣椒堿標準樣品在兩年內(nèi)未觀測到明顯的不穩(wěn)定性。

有效期t=24個月的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻為：

擴展不確定度U擴=2U=0.065×2=0.13

2.4定值

定值是指采用技術(shù)上有效的方法，確定樣品的一個或多個特征值的程序。此程序?qū)е庐a(chǎn)生標準樣品證書或相應文件。標準樣品定值一般情況下采用技術(shù)有效、嚴謹認可的方法來完成。實驗結(jié)果如表7。

對所采集的測定結(jié)果，采用格拉布斯（Grubbs）檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結(jié)果呈正態(tài)分布。根據(jù)GB/T 15000.3-2008/ISO Guid 35：2006《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則為和統(tǒng)計方法》標準規(guī)定，定值結(jié)果由標準值和不確定度組成。依據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得全部測定結(jié)果，計算出二氫辣椒堿標準樣品的標準值。標準樣品特性標準值的測量不確定度UCRM由標準值定值試驗的不確定度U（x=）、均勻性檢驗的不確定度Ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度Ults組成，檢測結(jié)果和數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理詳見定值報告。二氫辣椒堿標準樣品的HPLC純度定值結(jié)果為標準值：99.30%，置信度為95%的不確定度值：0.32%，實驗室內(nèi)標準偏差Sr：0.05%，實驗室間標準偏差SL：0.09%。

表7　二氫辣椒堿純度定值結(jié)果統(tǒng)計分析表Table 7The statistic analysis of dihydrocapsaicin purity value results

3結(jié)論

本研究針對我國缺少二氫辣椒堿國家實物標準樣品的現(xiàn)狀，對二氫辣椒堿標準樣品進行研制，建立了二氫辣椒堿標準樣品的制備方法。根據(jù)GB/T 15000.3-2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》，對制得二氫辣椒堿樣品進行了均勻性、穩(wěn)定性及定值研究。制備出標準值為99.30%，擴展不確定度（95%置信區(qū)間）為0.32%的二氫辣椒堿標準樣品，該標準樣品符合國家一級標準樣品的技術(shù)規(guī)范要求，填補了國內(nèi)該領(lǐng)域的研究空白。該標準樣品的研制可滿足辣椒及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測、質(zhì)量控制工作的需求，為其檢測結(jié)果的準確性、可比性和溯源性提供技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典:2010年版一部［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2010，347-348

［2］Rainer Gamse.Capsaicin and nociception in the rat and mouse［J］. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology，1982，320（3）: 205-216

［3］F Y Lam，W R Ferrell.Capsaicin suppresses substance P-induced joint inflammation in the rat［J］.Neuroscience Letters，1989，105（1/2）: 155-158

［4］Lawrence G Sharpe，Jerome H Jaffe.Captopril and capsaicin modify opioid withdrawal in the morphine-dependent rat［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior，1989，33（4）:899-902

［5］A Peikert，M Hentrich，G Ochs.Topical 0.025%capsaicin in chronic post-herpetic neuralgia:efficacy，predictors of response and long-term course［J］.Journal of Neurology，1991，238（8）:452-456

［6］Joel E Bernstein，Lawrence C Parish，Marvin Rapaport，et al. Rosenbaum，Henry H.Roenigk Jr.Effects of topically applied capsaicin on moderate and severe psoriasis vulgaris［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，1986，15（3）:504-507

［7］Debra L Breneman，J Scott Cardone，Renee F Blumsack，et al. Topical capsaicin for treatment of hemodialysis-related pruritus［J］. Journal of the American Academy of Dermatology，1992，26（1）:91-94

［8］K Theesen，W Marsh.Relief of diabetic neuropathy with fluoxetine［J］.The Annals of Pharmacotherapy，1989，23（7/8）:572-574

［9］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35:2006標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法［S］.北京:中國標準出版社，2008

［10］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T15000.1-1994標準樣品工作導則（1）在技術(shù)標準中陳述標準樣品的一般規(guī)定（等效采用ISO Guide 6《在國際陳述標準樣品的一般規(guī)定》）［S］.北京:中國標準出版社，1994

［11］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T15000.2-1994標準樣品工作導則（2）標準樣品常用術(shù)語和定義（等效采用ISO Guide 30《標準樣品常用術(shù)語和定義》）［S］.北京:中國標準出版社，1994

［12］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 8170-2008數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定［S］.北京:中國標準出版社，2008

［13］趙愛云，石磊，李釤.辣椒堿的分離純化及分析［J］.青島大學學報（工程技術(shù)版），2004，19（4）:24-26

［14］艾秀珍，沈波，危鳳，等.反相制備液相色譜分離純化辣椒堿單體［J］.高?；瘜W工程學報，2008，22（5）:774-778

［15］Fuwei Li，Yunliang Lin，Xiao Wang，et al.Preparative isolation and purification of capsaicinoids from Capsicum frutescens using highspeed counter-current chromatography［J］.Separation and Purification Technology，2009，64（3）:304-308

［16］Peter M Gannett，Donald L Nagel，Pam J Reilly，et al.The Capsaicinoids:TheirSeparation，Synthesis，and Mutagenicity［J］.J Org Chem，1988，53:1064-1071

Preparation of Certified Reference Materials of Dihydrocapsaicin

CHEN Jing-xian1，2，WANG Dai-jie2，*，ZHOU Xiao-jing3，MOU Yu-zhu4，LI Qiang2，GENG Yan-ling2，YU Jin-qian2，WANG Xiao2，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal Univesity，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Academy of Sciences，Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，Shandong，China；3.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；4.Yantai Changyu Pioneer Wine Co.，Ltd.，Yantai 264000，Shandong，China）

To establish the preparation technique of the certified reference material of dihydrocapsaicin. Dihydrocapsaicin was prepared by Pd/C catalytic hydrogenation of capsaicin extract and recrystallization.Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR.The homogeneity and stability were systematic checked.A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories.The results showed that the certified value of the reference material of dihydrocapsaicin was 99.30%with the expanded uncertainty of 0.32%in confidence coefficient of 95%.The reference material of dihydrocapsaicin can conform to the technical requirement of the certified reference material.The materials were intended for use in the method validation and quality control of regarding products.

dihydrocapsaicin；certified reference material；homogeneity；stability；certification；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.020

2014-04-21

2013國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201310243）；山東省海外高層次人才資助專項資金；北京市科學技術(shù)研究院市級財政項目（PXM2013_178305_000009）

陳靜嫻（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學。