羥乙基-β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取山楂中花青素的研究

李志英，董晶，張姝

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

羥乙基-β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取山楂中花青素的研究

李志英，董晶，張姝

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

以羥乙基-β-環(huán)糊精的乙醇溶液為提取介質(zhì)，用微波輔助提取山楂中的花青素，用紫外分光光度法測定山楂中的花青素的得率。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗的方法。研究表明最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為60%，微波功率為325 W微波提取時間為120 s，料液比（g/mL）1∶10，羥乙基-β-環(huán)糊精的用量m（山楂）∶m（羥乙基-β-環(huán)糊精）為1∶0.8。正交試驗優(yōu)化結(jié)果為：功率為260 W，微波時間為90 s，料液比為1∶20。在優(yōu)化條件下提取山楂中花青素的得率為：3.35 mg/g。羥乙基-β-環(huán)糊精的加入，有效提高了花青素的得率。

山楂；花青素；羥乙基-β-環(huán)糊精；微波提取

山楂為薔薇科植物山楂或野山楂的果實，在我國資源豐富。山楂以果實入藥，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用食物，廣泛應(yīng)用于保健食品和藥劑中。山楂具有消食健胃和行氣散瘀的功能［1］，近代研究結(jié)果表明，山植中含有豐富的有機酸、黃酮類、多酚類成分、三菇酸、維生素C、果膠、糖類、多種微量元素和礦物質(zhì)，這些化合物有多方面的藥理作用［2］。

原花青素是清除自由基很強的抗氧化劑，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，能防治多種因自由基引起的疾病包括心臟病、關(guān)節(jié)炎等。此外，原花青素還具有改善人體微循環(huán)功能，改善視覺功能，預(yù)防心腦血管疾病，抗輻射，抗腫瘤等多種功能［3］。

微波萃取是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，其最大特點是作用時間短，速度快，提取效率高，適用范圍廣［4］。國外關(guān)于提取花青素的報道很多［5］，一般采用水煮法和溶劑提取法［6］。水煮法耗能大，操作困難。溶劑提取法得率高，但成本高且安全性低，更可能造成環(huán)境污染。近年來，微波技術(shù)以其促進(jìn)反應(yīng)的高效性和選擇性加熱、操作簡便、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高及產(chǎn)物易于提純等優(yōu)點，已應(yīng)用于有機合成、酯化等反應(yīng)中，目前也有文獻(xiàn)報道用于天然產(chǎn)物的提?。?］。本論文對山楂中花青素的羥乙基-β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行了研究，為天然抗氧化劑提供一定的科學(xué)參考。

1試驗與方法

1.1儀器與試劑

UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；分光光度計（723#）：上海光譜儀器有限公司；LG型家用微波爐：天津市東金電子電器有限公司；電子分析天平（AL104）：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；中草藥粉碎機（FW135型）：天津市泰斯特儀器有限公司；60目篩：浙江省上虞市紗篩廠制造；HK-1D型恒溫水浴鍋：南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所。

山楂（購于忻州市五臺山藥店）去除雜質(zhì)，用粉碎機粉碎，過60目篩，得到山楂粉末，裝瓶待用。其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2溶液的配制

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，四川省維克寄生物科技有限公司）：準(zhǔn)確稱取10 mg花青素標(biāo)準(zhǔn)品定溶于10 mL甲醇中得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；香草醛-甲醇溶液：稱取10.000 g香草醛溶于甲醇溶液中，定容到250 mL，得到40 mg/mL的香草醛-甲醇溶液。

1.3山楂中花青素的提取

稱取1.0 g山楂樣品于圓底燒瓶中，分別加入0.8 g羥乙基-β-環(huán)糊精，然后加入60%的乙醇10 mL，在微波功率為325 W下輻射120 s，提取液定容至50 mL容量瓶，過濾，留上清液待測。

1.4山楂中花青素含量的測定

精確吸取樣品提取液1.0 mL于10 mL比色管中，加入濃度為40 mg/mL的香草醛-甲醇溶液6.0 mL和濃鹽酸3.0 mL，定容到10 mL，恒溫（30℃）避光反應(yīng)30 min，以香草醛-甲醇溶液∶濃鹽酸∶60%乙醇=6∶3∶1（體積比）的混合溶液作對照，在紫外分光光度計上測得波長505 nm處的吸光度值A(chǔ)505nm得率=（cV× 103）f/W×100%，式中：V為定容體積，mL；c為花青素提取液濃度，（μg/mL）；f為稀釋因子；W為山楂粉末的質(zhì)量。

2結(jié)果與討論

2.1最大吸收波長

取10 mL比色管3支，各加入1 mL的1 mg/mL花青素標(biāo)準(zhǔn)液，60%乙醇提取液，60%乙醇+羥乙基-β-環(huán)糊精提取液，按1.4的試驗方法，以未加對照品的試劑空白作參比，于波長400 nm～800 nm處測定吸收譜，結(jié)果見圖1。

圖1花青素提取液與花青素標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜比較Fig.1Camparison of absorption spectrum of anthocyanin extracts and anthocyanin standard

圖1中，曲線1為乙醇+羥乙基-β-環(huán)糊精提取反應(yīng)液，曲線2為乙醇提取反應(yīng)液，曲線3為花青素標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液，三者均在505 nm處有最大吸收波長，且加入羥乙基-β-環(huán)糊精對最大吸收波長無影響，以羥乙基-β-環(huán)糊精為提取介質(zhì)增加了花青素的得率。

2.2花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定［8］

準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法，在505 nm下測定其吸光度值。得回歸方程為：y=11.075x+0.029 3，r=0.999 0。試驗測得花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.01mg/mL～0.1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.3提取介質(zhì)的選擇

稱取1.0 g山楂4份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取提取介質(zhì)分別為10 mL蒸餾水、10 mL 60%乙醇、10 mL 60%乙醇+1.0 g β-環(huán)糊精、10 mL 60%乙醇+1.0 g羥乙基-β-環(huán)糊精，得提取液，按1.4的試驗方法測定花青素的得率。結(jié)果如表1。

表1　提取介質(zhì)對花青素得率的影響Table 1Effect of extraction medium on the yield of anthocyanins

如表1所示，以羥乙基-β-環(huán)糊精為提取介質(zhì)山楂中花青素的得率最高，因此本試驗選擇羥乙基-β-環(huán)糊精為花青素的提取介質(zhì)。

2.4羥乙基-β-環(huán)糊精用量對花青素得率的影響

稱取1.0 g山楂樣品5份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取羥乙基-β-環(huán)糊精的用量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，得提取液，精確吸取樣品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法測定，結(jié)果如表2。

表2　羥乙基-β-環(huán)糊精用量對花青素得率的影響Table 2Effect of Hydroxyethyl-β-cyclodextrin amount on the yield of anthocyanins

由表2說明，隨著羥乙基-β-環(huán)糊精用量增加，花青素得率也增加，當(dāng)羥乙基-β-環(huán)糊精用量大于0.8 g時得率有下降趨勢，因此選取羥乙基-β-環(huán)糊精用量為0.8 g進(jìn)行正交試驗為宜。

2.5微波功率對花青素得率的影響

稱取1.0 g山楂樣品5份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取提取功率分別為195、260、325、390、455 W，得提取液，精確吸取樣品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法測定，結(jié)果如表3。

表3　微波功率對花青素得率的影響Table 3Effect of microwave power on the yield of anthocyanins

由表3說明，隨著微波功率增大，花青素得率增大，當(dāng)微波功率超過325 W時得率明顯下降，可能因為功率大時造成花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至是碳環(huán)裂解，導(dǎo)致得率降低，因此選取微波功率為325 W進(jìn)行正交試驗為宜。

2.6料液比對花青素得率的影響

稱取1.0g山楂樣品5份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL，得提取液，精確吸取樣品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法測定，結(jié)果如表4。

由表4可知，隨料液比增加，花青素得率增大，當(dāng)料液比大于1∶10時，得率逐漸下降，因此選取料液比1∶10進(jìn)行正交試驗為宜。

2.7微波得時間對花青素得率的影響

稱取1.0 g山楂樣品5份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取提取時間分別為90、120、150、180、200s，得提取液，精確吸取樣品1.0mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法測定，結(jié)果如表5。

表4　料液比對花青素得率的影響Table 4Effect of ratio of material to liquid on the yield of anthocyanins

表5　微波時間對花青素得率的影響Table 5Effect of time on the yield of anthocyanins

由表5的試驗數(shù)據(jù)說明，當(dāng)提取時間大于120s時，得率逐漸下降，可能因為時間長溫度高破壞了花青素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率的下降，因此選取微波提取時間為120 s進(jìn)行正交試驗為宜。

2.8乙醇濃度對花青素得率的影響

稱取1.0g山楂樣品5份于圓底燒瓶中，按1.3的試驗方法，固定其它條件不變，選取乙醇溶液濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%得提取液，精確吸取樣品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的試驗方法測定，結(jié)果如表6。

表6　乙醇濃度對花青素得率的影響Table6Effectofethanolconcentrationontheyieldofanthocyanins

由表6的試驗數(shù)據(jù)說明，隨著乙醇濃度增加花青素得率增加，當(dāng)乙醇濃度大于60%時，得率有下降趨勢，考慮節(jié)省藥品及得率，因此選取乙醇濃度為60%進(jìn)行正交試驗為宜。

2.9正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定微波功率、微波輔助提取時間和料液比進(jìn)行優(yōu)化組合，以所測得率為考查指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出提取花青素的最佳工藝參數(shù)。

表7　正交試驗因素水平Table 7Factor and levels of the orthogonal experiment

表8　微波法正交試驗極差結(jié)果分析表Table 8The orthogonal experiment design and result analysis

由表8中極差R值分析可知各因素影響大小順序為C（提取時間）＞B（功率）＞A（料液比），最佳試驗方案是A3B1C1即最佳的提取工藝為微波功率為260 W，微波時間為90 s，料液比為1∶20（mg/g）。

2.10不同提取條件比較試驗

分別稱取1.0 g山楂樣品兩份于兩個圓底燒瓶中，一份加入0.8 g羥乙基-β-環(huán)糊精，然后加入60%的乙醇10 mL，在微波功率為325 W下輻射120 s，另一份加入0.8 g羥乙基-β-環(huán)糊精，然后加入60%的乙醇20 mL，在微波功率為260 W下輻射90 s，提取液分別定容至50 mL容量瓶，過濾，按1.4的試驗方法測定。得率分別為3.35 mg/g和3.34 mg/g，二者相差不大。

2.11對DPPH的清除作用的比較

取1.0 g山楂樣品和0.8 g羥乙基-β-環(huán)糊精于圓底燒瓶中，在最佳條件下進(jìn)行微波提取，得花青素提取液，按1.3的試驗方法提取，按1.4的試驗方法測定其吸收光譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算花青素的濃度。然后分別配制與花青素濃度相等的蘆丁溶液和VC溶液。用DPPH法［9］檢測上述三種溶液的抗氧化性。分別各取上述三種溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管中，各加入0.5 mg/mL的DPPH溶液1 mL，定容，靜置30 min后，在波長517 nm處測定其吸光度，計算得率。結(jié)果如圖2。

圖2　對DPPH的清除作用的比較Fig.2Comparison of scavenging effect on the DPPH

由圖2中曲線1可知，羥乙基-β-環(huán)糊精對DPPH無清除作用。由2、3、4曲線可知，三種溶液濃度相等的情況下，花青素的抗氧化性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蘆丁和VC，而蘆丁的抗氧化性又比VC小，說明花青素是很強的抗氧化劑，因此能治療多種因自由基引發(fā)的疾病。

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Study on the Microwave-β-CD Assisted Extraction Anthocyanins from Crataegus

LI Zhi-ying，DONG Jing，ZHANG Shu
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Microware method was used to extract the anthocyanins from Crataegus with the hydroxyethyl-β-CD-ethanol as medium.The yield of the anthocyanins was determined by UV-spectrophotometry.The optimum extraction conditions were investigated through orthogonal test according to single factor experiment.The optimum extraction conditions of single factor experiment were obtained as follows：ethanol concentration 60%，microwave power 325 W，extraction time 120 s，solid to liquid ratio 1∶10 and the mass ratio of crataegus with β-CD was 1∶0.8.Under the optimum conditions，the orthogonal test was obtained as follows：microwave power 260 W，extraction time 90 s，solid to liquid ratio of 1∶20.The yield of anthocyanins was obviously increased in the presence of β-CD and 3.35 mg/g was reached.The yield of anthocyanins was improved through the addition of hydroxyethyl-β-cyclodextrin.

crataegus；anthocyanins；hydroxyethyl-β-CD；microwave extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.009

2014-03-13

忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實踐基地（院政字201331）；忻州師范學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（2012.1022）

李志英（1970—），女（漢），教授，碩士，從事分析化學(xué)教學(xué)與科研工作。