槐米中蘆丁的提取及抗氧化活性研究

洪軍，胡曉穩(wěn)，王佩，李丹丹

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山467036）

槐米中蘆丁的提取及抗氧化活性研究

洪軍，胡曉穩(wěn)，王佩，李丹丹

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山467036）

為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用來(lái)自槐米中的蘆丁，采用堿提酸沉法獲得蘆丁粗提物，并通過(guò)普魯士藍(lán)法、水楊酸法、鄰苯三酚法和ABTS法分別探討了槐米中蘆丁提取物對(duì)Fe3+的還原能力，以及對(duì)·OH、O2-·和ABTS自由基的清除能力。結(jié)果表明：與VC相比，槐米中蘆丁提取物在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)的還原能力和對(duì)·OH自由基的清除能力較強(qiáng)；對(duì)O2-·和ABTS自由基的清除能力較弱。

槐米；蘆丁粗提物；抗氧化活性

蘆丁（Rutin），又稱蕓香甙，屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一類化合物，尤其在高等植物中含量較多。近年來(lái)，黃酮類化合物已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥、食品及化妝品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它不僅是天然活性成分中極具應(yīng)用潛力的資源之一，而且是低毒甚至無(wú)毒的藥用成分，具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化、延緩衰老等作用［1-3］。蘆丁也已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品和化妝品中，具有很高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。我國(guó)蘆丁的生產(chǎn)主要從槐米中提取，含量最高可達(dá)30%左右?；泵诪槎箍浦参锘钡母稍锘ɡ偌盎?，中國(guó)各地均有分布，其中以黃土高原和華北平原居多。作為藥食兩用植物，價(jià)格低廉、無(wú)毒無(wú)害、分布及應(yīng)用相當(dāng)廣泛。

本試驗(yàn)采用堿提酸沉法從槐米中提取蘆丁粗提物，隨后對(duì)其粗提物進(jìn)行還原能力、·OH、O2-和ABTS自由基的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，一方面為開(kāi)發(fā)槐米蘆丁的抗氧化性能的研究提供科學(xué)依據(jù)，另一方面為進(jìn)一步促進(jìn)我國(guó)槐米資源的綜合利用，創(chuàng)造出更高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

1材料與方法

1.1材料與儀器

槐米自購(gòu)于平頂山九頭崖超市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、水楊酸、過(guò)硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、VC等均為分析純；T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1原料處理

槐米，放入烘箱60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩備用。

1.2.2蘆丁的提取

采用堿提酸沉法，取槐米適量于圓底燒瓶中，加入一定量飽和氫氧化鈣和少量硼砂，pH調(diào)至8～9，煮沸后過(guò)濾，濾渣重復(fù)操作，合并濾液，鹽酸調(diào)pH 4～5，靜置沉淀吸除上清液，沉淀物反復(fù)水洗，干燥得粗提物［4］。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及粗提物蘆丁含量測(cè)定

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定出樣品的吸光度，由回歸方程計(jì)算出樣品溶液中蘆丁的質(zhì)量，并計(jì)算蘆丁提取率。

1.2.4粗提物蘆丁的抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1用普魯士藍(lán)法測(cè)定粗提物還原能力

參照文獻(xiàn)［5］方法并做改進(jìn)，配制VC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及粗提物蘆丁濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的樣液，反應(yīng)體系為：移取1 mLVC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及蘆丁粗提物溶液于不同的比色管中，依次加入1 mL0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6），1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3Fe（CN）6溶液，50℃下水浴20 min，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，3000r/min下離心10min后取2 mL上清液，加入3 mL去離子水，0.2 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻以后用去離子水作對(duì)照組，700 nm下測(cè)其吸光度。吸光度值越大表明還原力越強(qiáng)。然后以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值大小為縱坐標(biāo)，在同坐標(biāo)中表示出VC與蘆丁樣品的抗氧化活性。

1.2.4.2對(duì)·OH自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［6］方法并做改進(jìn)，配制VC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及粗提物蘆丁濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣液。將7.5 mmol/L FeSO4溶液、7.5 mmol/L水楊酸乙醇溶液和7.5 mmol/L H2O2溶液按1∶1∶1的比例混合，作為檢測(cè)儲(chǔ)備液備用。分別移取上述樣液1 mL于5 mL容量瓶中，加入2 mL檢測(cè)儲(chǔ)備液，用去離子水定容至5 mL。用去離子水做空白對(duì)照調(diào)零點(diǎn)，在526 nm處測(cè)定樣品吸光值為A1。以去離子水代替上述樣品溶液，其他步驟同上，得A0，根據(jù)以下公式計(jì)算清除率。

式中：I為樣品對(duì)OH·的清除率；A0為不含樣品的檢測(cè)液的吸光度值；A1為含樣品的檢測(cè)液的吸光度值。

1.2.4.3對(duì)除O2-·的清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［6］方法并做改進(jìn)，配制VC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及粗提物蘆丁濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣液。取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL和不同濃度的樣液1 mL于試管中，25℃水浴預(yù)熱20 min，之后加入0.2 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后25℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入1.0 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)。以Tris-HCl溶液為調(diào)零點(diǎn)，在320 nm處測(cè)定樣品吸光度為A1，同體積的蒸餾水代替樣品提取液，測(cè)定吸光度為A0。計(jì)算參考1.2.4.2中對(duì)OH·清除率的公式。

1.2.4.4對(duì)ABTS+清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［6］方法并做改進(jìn)，將7 mmol/L的ABTS與1.4 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，室溫12℃～16℃避光放置16 h，成ABTS+儲(chǔ)備液。臨用前用無(wú)水乙醇稀釋至吸光度為0.7+0.02，得ABTS+工作液。取2.8mL ABTS+工作液與0.2 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣品室溫反應(yīng)6 min后迅速于734 nm處測(cè)定A1。以去離子水代替上述樣品溶液，其他步驟同上，得A0。計(jì)算參考1.2.4.2中對(duì)OH·清除率的公式。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及粗提物蘆丁含量測(cè)定

制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明線性范圍寬，重現(xiàn)性好，回歸方程為：y=0.533 8x+0.003 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，粗提物蘆丁得率為19.3%。

2.2粗提物蘆丁的抗氧化活性測(cè)定

2.2.1蘆丁粗提物的還原能力及對(duì)羥基（·OH）自由基清除能力測(cè)定

蘆丁粗提物的還原能力及對(duì)羥基（·OH）自由基清除能力測(cè)定見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　蘆丁粗提物的還原能力Fig.1Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on reducing power

圖2　蘆丁粗提物對(duì)·OH的清除能力Fig.2Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on hydroxyl radical

由圖1和圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，VC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槐米中蘆丁提取物的還原能力及對(duì)·OH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。與VC相比，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槐米中蘆丁提取物的還原能力及對(duì)·OH自由基清除能力較強(qiáng)。在質(zhì)量濃度為20 μg/mL～100 μg/mL時(shí)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的還原能力最強(qiáng)；但在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)蘆丁粗提取物對(duì)·OH自由基清除能力與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)，清除率最高可達(dá)40%以上。

2.2.2蘆丁粗提物對(duì)超氧陰離子（O2-·）和ABTS+自由基清除能力測(cè)定

蘆丁粗提物對(duì)超氧陰離子（O2-·）和ABTS+自由基清除能力測(cè)定見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　蘆丁粗提物對(duì)O2-·清除效果Fig.3Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on superoxide anion radical

圖4　蘆丁粗提物對(duì)ABTS自由基的清除效果Fig.4Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on ABTS radical

由圖3和圖4可知，隨著濃度的升高（0.2 mg/mL～1.0 mg/mL），VC、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槐米中蘆丁提取物對(duì)O2-·和ABTS+的清除能力均在逐漸增強(qiáng)；但與VC相比，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槐米中蘆丁提取物對(duì)O2-·和ABTS+清除能力較弱，而來(lái)自槐米中蘆丁提取物在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時(shí)與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)O2-·和ABTS+的清除能力相當(dāng)。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)堿提酸沉法提取了槐米中的蘆丁并對(duì)粗提物進(jìn)行抗氧化活性的研究，結(jié)果表明，與VC相比，蘆丁粗提物對(duì)·OH自由基清除能力和還原能力較強(qiáng)，但對(duì)O2-·和ABTS+自由基清除能力較弱。

已有研究結(jié)果表明，當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多時(shí)，這些自由基如·OH、ABTS、O2-·自由基對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生氧化損傷作用，引起機(jī)體組織器官發(fā)生各種病變，尤其·OH自由基可導(dǎo)致基因的變異［7］。有報(bào)道表明，槐米提取物對(duì)豬油具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)氧化性能，以及對(duì)DPPH自由基和·OH自由基的清除效果較好［8］，與本研究報(bào)道的對(duì)·OH自由基具有較強(qiáng)的清除效果相一致。從槐花中提取的蘆丁對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，其IC50分別為28.39、69.88 μg/mL［9］。這些結(jié)果均表明了蘆丁具有較好的抗脂質(zhì)氧化能力及清除自由基的能力。本研究為槐米的開(kāi)發(fā)利用提供理論支持，同時(shí)也為槐米中提取的蘆丁的抗氧化提供理論參考。

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Rutin Extraction from Sophara Japonica and It Antioxidant Activities

HONG Jun，HU Xiao-wen，WANG Pei，LI Dan-dan
（College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，Henan，China）

To further the development and utilization rutin from sophara japonica，rutin crude extract was obtained using alkaline acid sinking method.Scavenging activities of rutin from sophara japonica on Fe3+reducing power，·OH，O2-·and ABTS radicals using Prussian blue，Salicylic acid，F(xiàn)enton reaction and ABTS methods were investigated.The results showed that，compared with VC，rutin from sophara japonica had stronger scavenging ability on Fe3+reducing power and·OH radicals，also it had weaker effects on O2-·and ABTS radicals at 0.2 mg/mL-1.0 mg/mL concentrations.

sophara japonica；rutin crude extract；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.005

2014-06-20

河南城建學(xué)院博士啟動(dòng)基金

洪軍（1977—），女（漢），講師，博士，主要從事活性物質(zhì)的提取及多肽的作用機(jī)理研究。