金剛烷胺ELISA試劑盒的研制

吳小平王文珺劉螢邢維維蘇麗芳

（1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 北京 100095；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局）

金剛烷胺ELISA試劑盒的研制

吳小平1王文珺1劉螢2*邢維維1蘇麗芳1

（1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 北京 100095；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局）

［目的］研制金剛烷胺ELISA快速檢測試劑盒，用以檢測雞肉中金剛烷胺殘留量。［方法］在金剛烷胺單克隆抗體基礎(chǔ)上，用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法研究試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)。［結(jié)果］研制的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.5-40.5 μg/L，線性回歸方程為y=-2.0574x+0.4763（R2=0.9967），IC50濃度值為1.9 μg/L；對雞肉中金剛烷胺的檢出限為0.25 μg/kg，添加回收率范圍為76.0%-109.0%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。［結(jié)論］該試劑盒具有快速、靈敏、穩(wěn)定的特點(diǎn)，各項(xiàng)指標(biāo)性能良好，可用于雞肉中金剛烷胺殘留的定性或半定量檢測。

金剛烷胺；試劑盒；檢測；雞肉

1 前言

金剛烷胺（amantadine，AMT）屬于三環(huán)胺類，多以鹽酸鹽形式存在，分子式：C10H18NCl［1］。常溫下為白色結(jié)晶性粉末，在乙醇和水中易溶，在三氯甲烷中溶解，呈堿性［2］。金剛烷胺可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞，并影響病毒的脫殼，抑制其繁殖，可用于各種A型流感病毒及帕金森綜合癥的治療［3，4］。但金剛烷胺對食用者可能產(chǎn)生嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心、食欲減退等多種不良反應(yīng)，具有一定的毒副作用［1］。而且，長期使用金剛烷胺可以使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性，誘導(dǎo)產(chǎn)生新型耐藥病毒［5］。因此，我國農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告明確規(guī)定金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在獸醫(yī)上禁止使用，美國FDA于2005年也禁止將金剛烷胺和金剛乙胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類［6，7］。

目前，檢測金剛烷胺的方法有氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜法（HPLC）和液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS），這些方法所需儀器昂貴，前處理過程復(fù)雜，操作時(shí)間過長，無法在基層檢測機(jī)構(gòu)推廣［8，9］。以免疫學(xué)檢測技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來的酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）試劑盒可為建立監(jiān)控動(dòng)物性食品中金剛烷胺殘留提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試劑

乙腈（分析純）等生化試劑：購自上海華美公司；阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品：購自sigma公司。

2.1.2儀器

均質(zhì)器（JZ-II型）：購自莆田市南榮貿(mào)易有限公司；電子天平（2000SBL）：購自美國Setra；氮吹儀（KL512）：購自美國Organomation；低速離心機(jī)（Anke TDL-40B）：購自上海安亭科學(xué)儀器；漩渦混合器（QL-901）：購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀（MK3）、微量移液器：購自美國Thermo；生化培養(yǎng)箱（DHP-600）：購自天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

2.2方法

2.2.1溶液系統(tǒng)

各溶液參考宮慧芝所述方法配制［10］。

2.2.2抗體制備

分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株由本公司建立，利用BALB/c小鼠體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法制備抗體，采用飽和硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化?？贵w的特異性和靈敏度采用間接競爭ELISA法進(jìn)行測定。

2.2.3ELISA方法建立

將上述制備的抗金剛烷胺單克隆抗體包被于酶標(biāo)板微孔，配制質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)液，參照劉百紅所述方法建立直接競爭ELISA檢測體系。檢測步驟如下：加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于設(shè)定酶標(biāo)板微孔中；然后加入金剛烷胺酶標(biāo)抗原工作液50 μL；輕敲微孔板邊緣混勻1 min，25℃恒溫箱中避光反應(yīng)30 min；洗板3次，每次加入洗滌液250 μL，最后一次甩干余液，并在吸水紙上拍干；加入底物液100 μL，在25℃恒溫箱中避光反應(yīng)15 min后加入終止液100 μL；用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔吸光度值（Optical density，OD）［11］。

2.2.4樣品前處理

用均質(zhì)器將動(dòng)物組織樣品均質(zhì)；稱取樣品3.0± 0.05g至50mL離心管中，加入乙腈6mL和金剛烷胺純化試劑（無水硫酸鈉）1.0 g，用渦旋儀渦動(dòng)3 min；25℃、4 000 r/min離心10 min；取2 mL上層乙腈至干凈玻璃試管中，置于60℃-70℃水浴鍋中用氮?dú)饬鞔蹈?；加?.5 mL金剛烷胺樣品提取液（1%三氯乙酸+甲醇，以體積比1∶1混勻），用渦旋儀渦動(dòng)2 min；取100 μL進(jìn)行樣品測試。

3 結(jié)果

3.1ELISA工作曲線

圖l為金剛烷胺ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。曲線呈典型的S型，回歸方程為：y=-2.0574x+0.4763，相關(guān)系數(shù)R2為0.9967，IC50濃度值為1.9 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的吸光百分比值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（RSD）為1.7%-8.6%。結(jié)果表明金剛烷胺試劑盒在0.5-40.5 μg/L濃度范圍具有良好線性。

圖1　金剛烷胺試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2基質(zhì)干擾測試

分析PBS緩沖液、雞肉樣品處理液2種基質(zhì)對繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，將金剛烷胺分別溶于2種基質(zhì)中，配制成濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)液，按照金剛烷胺試劑盒的操作方法測定，繪制曲線進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

圖2　不同基質(zhì)對金剛烷胺-Kit影響

圖2顯示，不同基質(zhì)的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值不同。雞肉處理液測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=-2.2322x+0.7257，相關(guān)系數(shù)R2為0.9909，IC50濃度值為2.2 μg/L，表明盡管不同基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值有一定影響，但其IC50變化差異不大，對金剛烷胺試劑盒的敏感性和檢測結(jié)果影響不大，上述樣品前處理方法可行。

3.3樣品檢出限

用本試劑盒檢測20份空白雞肉樣品，結(jié)果見表1。空白樣品的平均值（）加3倍標(biāo)準(zhǔn)差（SD），即為雞肉樣本的檢出限（LOD），LOD=+3SD。

表1　檢出限結(jié)果

由表1可得，檢測結(jié)果平均值為0.081 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為0.046，因此本試劑盒雞肉檢出限為0.22μg/kg?？紤]到實(shí)際檢測工作中的需要和操作方面的誤差，最終確定本試劑盒對雞肉的檢出限為0.25 μg/kg。

3.4準(zhǔn)確度和精密度測試

準(zhǔn)確度和精密度分別以回收率和變異系數(shù)表示。分別在陰性雞肉中添加不同濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度添加5份樣品，共用3個(gè)批次試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算樣品回收率和變異系數(shù)，以評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。

表2　準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果

結(jié)果顯示，回收率范圍為76.0%-109.0%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為3.9%-11.8%，批間變異系數(shù)范圍為9.1%-11.2%，均未超過15%，表明金剛烷胺試劑盒具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3.5實(shí)際樣品檢測驗(yàn)證結(jié)果

用ELISA試劑盒法和儀器法分別檢測10份雞肉盲樣，比較測定結(jié)果。LC-MS方法參照DB 21/ 2394-2014《雞肝和雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺的檢測超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行，方法對雞肉中金剛烷胺的檢測限為0.5 μg/kg。以試劑盒檢測限作為陰陽性判定值，小于試劑盒檢測限試劑盒檢測結(jié)果記為“-”，儀器結(jié)果記為“ND”，大于試劑盒檢測限以實(shí)際檢測值表示，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，二者的符合率為100%。

表3　ELISA法與儀器方法比較結(jié)果

4 討論

國家對食品安全問題越來越重視，因此ELISA檢測技術(shù)在農(nóng)藥、獸藥殘留、生物毒素、毒品及真菌毒素等檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，同時(shí)，對ELISA試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性等技術(shù)指標(biāo)也提出了更高的要求。

基質(zhì)效應(yīng)可能抑制免疫結(jié)合反應(yīng)，使競爭效率下降，從而導(dǎo)致曲線異常，斜率減小，IC50增大，靈敏度下降。本試劑盒對PBS緩沖液、雞肉樣品處理液2種基質(zhì)所測標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50變化不大，說明本試劑盒所采用的樣品處理方法可行。

5 結(jié)論

本研究研制的雞肉中金剛烷胺殘留檢測ELISA試劑盒檢出限為0.25 μg/kg，且性能良好，可用于雞肉中金剛烷胺殘留的定性或半定量檢測。

［1］胡巧茹，周長朋，張玉春，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定辣椒及辣椒制品中金剛烷胺殘留［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2014，33（10）：1184-1188.

［2］蘇文清，蒙君麗.取代禁用漁藥的新藥介紹（三）［J］.河北漁業(yè)，2003，128（2）：26-27.

［3］張向榮.抗病毒藥物的應(yīng)用及其研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2001，5（4）：254-255.

［4］王新德.帕金森病治療進(jìn)展概況［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2000，4（3）：324-325.

［5］姚亞妮，楊新玲.新型多巴胺受體激動(dòng)劑與帕金森?。跩］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8（5）：538-540.

［6］蔣增海，鄧同煒，李文剛，等.豬群利巴韋林中毒病例［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，49（9）：83-83.

［7］云環(huán)，崔風(fēng)云，嚴(yán)華，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺［J］.色譜，2013，31（8）：724-728.

［8］武潔，王大為，何志強(qiáng).LC-MS/MS法測定人血漿中的金剛烷胺濃度及其藥動(dòng)學(xué)［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2008，17（2）：109-111.

［9］葛孝忠，應(yīng)黃慧，陳曉，等.金剛烷類藥物的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，34（11）：583-586.

［10］宮慧芝，計(jì)融，楊軍，等.伏馬菌素B1免疫學(xué)檢測方法的建立［J］.中國公共衛(wèi)生，2006，22（7）：840-842.

［11］劉百紅，熊寧，王喜亮，等.直接競爭ELISA法快速檢測動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留［J］.中國獸藥雜志，2008，42（2）：16-19.

Development of an ELISA Kit for the Determination of Amantadine in Chicken Muscle

Wu Xiaoping1，Wang Wenjun1，Liu Ying2*，Xing Weiwei1，Su Lifang1
（1.Beijing WDWK Biotechnological Corporation Ltd，Beijing，100095；2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

［Objective］Development of direct ELISA kit for the determination of amantadine（AMT）in chicken muscle.［Method］Under the optimal condition，development of a direct ELISA based monoclonal antibody for the determination of AMT in chicken.［Result］Linear range of AMT ELISA kit was 0.5-40.5 ng/mL；regression equation：y=-2.0574x+0.4763（R2=0.9967），IC50=1.9 ng/mL.The limit of detection（LOD）of ELISA for DEX in chicken was 0.25 ng/g.The average recoveries of DEX from fortified samples by ELISA were in a range of 76.0%-109.0%and inter-and intra-coefficients of variation（CVs）was less than 15%.［Conclusion］AMT ELISA kit established in this study was rapid，sensitive and stable，which is good enough for the qualitative or half-quantitative determination of AMT in chicken muscle.

Amantadine；ELISA Kit；Chicken Muscle

R446.61

E-mail：wuxiaoping@wdwkbio.com；*通訊作者E-mail：liuying@bjciq.gov.cn.

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK306）

2015-06-09