超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝優(yōu)化研究

鄧維澤，唐顯福，古霞，閆天龍，楊文宇，李明元*，

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院/四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039；2.貴州赤水仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝優(yōu)化研究

鄧維澤1，唐顯福2，古霞1，閆天龍1，楊文宇1，李明元*1，2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院/四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039；2.貴州赤水仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

優(yōu)化超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝。以多糖提取得率為考察指標(biāo)，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量，采用單因素試驗(yàn)正交試驗(yàn)法考察了料液比、超聲波提取功率、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)金釵石斛多糖提取得率的影響。超聲波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：料液質(zhì)量體積比1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時(shí)間為50 min，在此條件下多糖得率為3.11%。

金釵石斛多糖；提?。还に噧?yōu)化；正交試驗(yàn)

金釵石斛，俗稱扁金釵，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物［1］，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，因其生長在特殊的環(huán)境和具有強(qiáng)大的滋補(bǔ)功效而成為“中國九大仙草”之一。金釵石斛可“益胃生津、補(bǔ)腎益力、延年益壽”，具有抗衰老，增強(qiáng)免疫力等功效［2-4］，其主要的功效成分是石斛堿及多糖類物質(zhì)。金釵石斛是國家批準(zhǔn)可用于保健食品的物品名單之一。目前，對(duì)于金釵石斛研究大多集中在石斛堿上，對(duì)于金釵石斛多糖的研究鮮見報(bào)道。作者利用超聲波法輔助提取金釵石斛多糖，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，為進(jìn)一步金釵石斛多糖的分離純化及其活性的研究提供一定的基礎(chǔ)，為金釵石斛多糖的開發(fā)及其相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

金釵石斛：貴州赤水仙草生物科技有限公司提供。烘干、粉碎，過40目篩，備用；透析袋：成都奧克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器UV2800紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-700DE型超聲波數(shù)控清洗儀：上海滬沁儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化公司產(chǎn)品；Alphal-2LD plus冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司產(chǎn)品。

1.2.2主要試劑無水葡萄糖、苯酚、硫酸、石油醚、無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿，均為分析純。

1.3方法

1.3.1試驗(yàn)樣品的前處理稱取金釵石斛干燥粉末，置于索氏提取器中，加入6倍體積石油醚80℃回流提取1 h，濾渣揮干溶劑，加入10倍體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，70℃回流提取2次，每次1 h，趁熱抽濾，濾渣揮干溶劑，60℃干燥至恒重備用。

1.3.2金釵石斛粗制多糖的制備稱取1.3.1中的樣品50 g，加入500 mL蒸餾水，超聲波提?。ǔ暅囟?0℃，超聲時(shí)間60 min，超聲功率300 W），趁熱過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇使溶液含乙醇體積分?jǐn)?shù)至80%，靜止過夜，離心得沉淀冷凍干燥即為金釵石斛粗制多糖。

1.3.3金釵石斛精制多糖的制備將1.3.2中的金釵石斛粗制多糖加蒸餾水溶解，溶液用活性炭除色素，Sevage法除去蛋白質(zhì)，反復(fù)操作直至紫外-可見光掃描無明顯蛋白質(zhì)吸收峰為止。用透析袋48 h流水透析，蒸餾水透析24 h，除去無機(jī)鹽、小分子雜質(zhì)及未除盡的色素，將透析袋內(nèi)多糖液醇沉，離心得沉淀，無水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷凍干燥至恒重即金釵石斛精制多糖［5-6］。

1.3.4金釵石斛多糖含量的測(cè)定方法金釵石斛多糖測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法［7］，在490 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算多糖含量。精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，配置成10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于9支比色管中，分別以水補(bǔ)至2.0 mL，另取1支比色管加入2.0 mL蒸餾水，作為空白對(duì)照，然后各自加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，混勻后，置于40℃水浴中加熱30 min，冷水冷卻至室溫，在波長490 nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.089 72X-0.004 6（R2=0.999 1）。

1.3.5換算因子的測(cè)定精確稱取干燥至恒重的金釵石斛精制多糖2.5 mg于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。從中精確吸取2.0 mL，按“1.3.4”的方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算換算因子f=（Cs/C）。Cs為實(shí)際金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的質(zhì)量濃度。由計(jì)算的結(jié)果可得換算因子f=1.32（n=3），純度=1/f=1/1.32=75.76%。

1.3.6金釵石斛多糖得率測(cè)定取金釵石斛提取工藝中制備的多糖稀釋液2 mL，按“1.3.4”操作，測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖稀釋液的質(zhì)量濃度。金釵石斛多糖得率=（f·C·N·V/m）；式中f為換算因子，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖稀釋液質(zhì)量濃度值，N為稀釋倍數(shù)，V為提取工藝中的濾液體積，m為試驗(yàn)樣品的質(zhì)量。

1.3.7金釵石斛多糖提取單因素試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取前處理干燥的金釵石斛粉3.0 g，放入200 mL的錐形瓶中，以水作為提取溶劑，在其他條件相同的情況下，采用不同的料液比、超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，然后趁熱過濾，精確測(cè)定濾液體積（V）。用移液管精確移取1 mL濾液于50 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數(shù)N），用“1.3.4”的方法測(cè)定金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，計(jì)算金釵石斛多糖得率，逐個(gè)考察各提取條件對(duì)提取效果的影響，確定每一因素的最佳水平。

1.3.8金釵石斛多糖提取正交試驗(yàn)根據(jù)1.3.7單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲波功率、時(shí)間、溫度4個(gè)因素及3個(gè)最佳水平進(jìn)行正交試驗(yàn)L9（34），超聲波輔助提取后按“1.3.4”的方法測(cè)定金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，并計(jì)算多糖得率，確定金釵石斛多糖提取的最佳條件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)多糖得率的影響在超聲波功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時(shí)間50 min的條件下，依1.3.7的試驗(yàn)方法，研究料液質(zhì)量體積比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)料液質(zhì)量體積比大于1 g∶20 mL時(shí)，金釵石斛多糖提取得率隨料液比的減小而提高，當(dāng)料液質(zhì)量體積比小于1 g∶20 mL時(shí)，金釵石斛多糖提取率隨料液比繼續(xù)減小，反而出現(xiàn)多糖提取率稍微下降的情況，從實(shí)驗(yàn)條件和后期處理成本出發(fā)，選擇1 g∶20 mL為最佳料液質(zhì)量體積比。

圖1　料液質(zhì)量體積比對(duì)多糖得率的影響Fig.1Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysccharides

2.1.2超聲波提取功率對(duì)多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時(shí)間50 min的條件下，依1.3.7的試驗(yàn)方法，研究超聲波提取功率為300、350、400、450、500、550 W時(shí)對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，金釵石斛多糖提取得率隨著超聲波提取功率增大，先增大而后減小的趨勢(shì)，在超聲波功率低于450 W時(shí)，多糖得率隨超聲波功率的增大而提高，在超聲波功率高于450 W時(shí)多糖得率又隨超聲波功率的增大而降低，可能是由于大的超聲波提取功率所產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)作用使多糖的糖苷鍵被打斷，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，使多糖得率降低［8-9］。因此選擇450 W為最佳超聲波提取功率。

圖2　超聲波提取功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysccharides

2.1.3超聲波提取溫度對(duì)多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取功率450 W、超聲波提取時(shí)間50 min的條件，依1.3.7的試驗(yàn)方法，研究超聲波提取溫度為40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，金釵石斛多糖提取率隨著超聲波提取溫度的升高而增大，在40～60℃時(shí)，多糖得率隨溫度的升高而呈顯著性增加，在60℃以后，多糖得率隨溫度的升高而極度緩慢的增加，從節(jié)約能源角度考慮，因此選擇60℃為最佳超聲波提取溫度。

圖3　超聲波提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of polysccharides

2.1.4超聲波提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取功率450 W、超聲波提取溫度60℃的條件，依1.3.7的試驗(yàn)方法，研究超聲波提取時(shí)間為10、30、50、70、90 min時(shí)對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。在超聲波提取時(shí)間10～50 min的范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，金釵石斛多糖提取得率也隨之提高，但是超過50 min后，繼續(xù)延長超聲波提取時(shí)間，金釵石斛多糖得率不再提高反而降低。這可能是超聲波處理時(shí)間短，多糖溶出不完全；處理時(shí)間過長，可能對(duì)會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，影響金釵石斛多糖得率。因此選擇40～60 min之間為最佳的超聲波提取時(shí)間。

圖4　超聲波提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4Effect of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polysccharide

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

金釵石斛多糖提取效果受多個(gè)因素的交叉影響。上述試驗(yàn)只是單因素影響，為了確定在提取過程中這4個(gè)因素對(duì)金釵石斛多糖提取效果的影響大小，選出最佳的提取條件。依“1.3.8”的試驗(yàn)方法，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5所示。

由表5可知，從極差R的大小可以看出影響金釵石斛多糖提取的4個(gè)因素的主次關(guān)系是：超聲波提取功率＞超聲波提取時(shí)間＞料液質(zhì)量體積比＞超聲波提取溫度。因素C的極差很小，所以將此列作為方差分析的誤差列［10］，結(jié)果見表6。F檢驗(yàn)表明，B因素（超聲波提取功率）P＜0.01，D因素（超聲波提取時(shí)間）P＜0.05，說明在B因素所設(shè)的不同水平下對(duì)金釵石斛提取效果有極顯著性差異，在D因素所設(shè)不同水平下有顯著性差異，其他因素各水平間差異均不顯著。

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出金釵石斛多糖得率最高的提取組合是A1B2C2D2，即料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時(shí)間為50 min。單因素試驗(yàn)中的4個(gè)單因素的最佳組合為A2B2C2D2，即料液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時(shí)間為50 min。下面對(duì)兩者進(jìn)行比較：提取功率、提取溫度、提取時(shí)間相同，料液質(zhì)量體積比的差異性不顯著，可以忽略不計(jì)?？紤]小的料液質(zhì)量體積比會(huì)給后續(xù)提取液的濃縮帶來困難以及節(jié)約能源，所以選擇1 g∶ 15 mL的料液質(zhì)量體積比更科學(xué)，更合理。綜上所述，本試驗(yàn)條件下確定最最佳的提取條件為料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時(shí)間為50 min。

表4　正交試驗(yàn)4因素3水平L9（34）表Table 4Four factors and three levels of L9（34）of the orthogonal test

表5　正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析表Table 5Results of the orthogonal test

表6　方差分析表Table 6Analysis of Variance table

3　結(jié)語

1）通過單因素及正交試驗(yàn)得出了超聲波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：料液質(zhì)量體積比1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時(shí)間為50 min。在此條件下金釵石斛多糖的提取得率達(dá)3.11%，各個(gè)因素對(duì)金釵石斛多糖得率的影響作用大小順序依次為超聲波提取功率＞超聲波提取時(shí)間＞料液比＞超聲波提取溫度，這為金釵石斛多糖的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

2）金釵石斛多糖超聲波輔助提取法與熱水回流提取法、水煎煮提取法比較見表7。

3）超聲波輔助提取是否影響金釵石斛活性多糖的結(jié)構(gòu)、破壞金釵石斛多糖的生物活性，還值得以后做進(jìn)一步的研究和論證。

表7　不同金釵石斛多糖提取法比較Table 7Comparison of different extraction methods for Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.

DENG Weize1，TANG Xianfu2，GU Xia1，YAN Tianlong1，YANG Wenyu1，LI Mingyuan*1，2
（1.College of Bioengineering/Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Province，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Guizhou Chishui Xian Cao Biological Technology Co.，Ltd，Chishui 564700，China）

The study aimed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.Using extraction rate as evaluation index，the polysaccharide content was assayed by the phenol-sulfuric method.Based on the orthogonal test，the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions were：material-liquid ratio 1∶15（g/mL），extraction power 450 W，temperature 60℃and time 50 min.With the optimal conditions，the extraction rate of polysaccharides was up to 3.11%.

Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides，extraction，process optimization，orthogonal test

R 931.71

A

1673—1689（2015）10—1101—06

2014-09-17

貴州省遵義市中藥重大專項(xiàng)赤中藥科合（201306）。

李明元（1965—），男，四川瀘州人，農(nóng)學(xué)博士，教授，主要從事食品質(zhì)量安全及營養(yǎng)保健研究。E-mail：limingyuan 519@qq.com