Taqman探針熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分

陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家外來(lái)病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海519015）

Taqman探針熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分

陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正*，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家外來(lái)病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海519015）

針對(duì)鯊魚(yú)產(chǎn)品摻雜造假增多而缺乏有效鑒定技術(shù)的情況，作者根據(jù)GenBank中鯊魚(yú)基因的線粒體DNA（mtDNA）序列，使用分子生物學(xué)軟件Primer Express 2.0設(shè)計(jì)了一套特異性引物和探針，用來(lái)建立Taqman探針熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分的方法。結(jié)果表明，對(duì)13份已鑒定為鯊魚(yú)魚(yú)翅的樣品進(jìn)行檢測(cè)，全部出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒(méi)有熒光增長(zhǎng)。方法特異性強(qiáng)，對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的12份鯊魚(yú)源性樣品及9份其他魚(yú)類(lèi)樣品進(jìn)行檢測(cè)，12份鯊魚(yú)樣品均出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，而非鯊魚(yú)樣品均未出現(xiàn)熒光增長(zhǎng)；方法靈敏度較高，可檢測(cè)到的最低質(zhì)?？截悢?shù)量級(jí)為10拷貝/μL；方法快速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于市場(chǎng)上魚(yú)翅等常見(jiàn)鯊魚(yú)源性產(chǎn)品的真假鑒定。

鯊魚(yú)源性成分；Taqman探針；熒光PCR；檢測(cè)

鯊魚(yú)隸屬于軟骨魚(yú)綱、板鰓亞綱、鯊總目，大約包括8目35科465多種［1］，是位于海洋食物鏈頂層的重要魚(yú)類(lèi)。以鯊魚(yú)為原料的加工產(chǎn)品包括魚(yú)翅、鯊魚(yú)硫酸軟骨素、鯊魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肉等，均具備一定的藥用、保健或營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［2，5］。近年來(lái)，由于鯊魚(yú)產(chǎn)品消費(fèi)趨熱，鯊魚(yú)的捕殺量常年在較高水平（73～80× 104t/year，數(shù)據(jù)來(lái)源：FAO Yearbook.Fishery and Aquaculture Statistics.2012）。在巨額經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，鯊魚(yú)產(chǎn)品摻雜造假的情況時(shí)有發(fā)生，尤其是魚(yú)翅類(lèi)產(chǎn)品造假更是屢見(jiàn)不鮮。目前對(duì)鯊魚(yú)產(chǎn)品的研究主要集中在鯊魚(yú)產(chǎn)品功能成分的提純和生物活性研究［2-4］、鯊魚(yú)產(chǎn)品對(duì)疾病的治療和保健機(jī)理［5-10］、鯊魚(yú)種屬鑒定［11-12］等方面，而對(duì)鯊魚(yú)產(chǎn)品市場(chǎng)所急需的鯊魚(yú)總類(lèi)成分檢測(cè)與鑒定技術(shù)（非鑒定到種）的研究還較為少見(jiàn)，僅見(jiàn)郭云霞等報(bào)道了針對(duì)鯊魚(yú)源性成分建立了PCR鑒別方法和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法［13-14］。為維護(hù)正常市場(chǎng)秩序和消費(fèi)者合法權(quán)益，迫切需要開(kāi)發(fā)出特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確的鯊魚(yú)源性成分檢測(cè)鑒定方法。作者利用熒光PCR特異性強(qiáng)、快速靈敏、簡(jiǎn)便而不易污染等特點(diǎn)建立了基于Taqman探針的熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分的方法。

1　材料與方法

1.1樣品

13份魚(yú)翅樣品為本實(shí)驗(yàn)室留存樣品，另外12份鯊魚(yú)源性樣品（包括4份新鮮鯊魚(yú)和8份魚(yú)翅樣品）及9份其他魚(yú)類(lèi)樣品（包括美洲鰻2份、日本鰻2份、龍頭魚(yú)1份、羅非魚(yú)1份、池魚(yú)1份、馬鮫魚(yú)1份、鳙魚(yú)1份）均購(gòu)自珠海海鮮及干貨市場(chǎng)。

1.2主要試劑

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit，美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品；TIANGEN Taq PCR Mastermix：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD 18-T、DNA Marker DL 2000：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3主要儀器

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System：美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；Alpha Imager HP凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Alpha Innotech公司產(chǎn)品；Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度計(jì)：美國(guó)NanoDrop Technologies公司產(chǎn)品。

1.4普通PCR引物及熒光PCR引物、探針的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank中公布的鯊魚(yú)線粒體DNA（mtDNA）序列，利用生物學(xué)軟件Clustal X比對(duì)后在高度保守區(qū)域用Primer Express 2.0分別設(shè)計(jì)了一對(duì)普通PCR引物和一套熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針序列見(jiàn)表1。

表1　引物和探針序列Table 1Sequences of primers and probe

1.5魚(yú)翅樣品的普通PCR擴(kuò)增及種屬鑒定

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品DNA。以13份魚(yú)翅樣品DNA為模板進(jìn)行普通PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，100 μmol/L上下游引物各1.0 μL，DNA模版2.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序：94℃2 min；94℃30 s，50℃1 min，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。擴(kuò)增結(jié)束后于質(zhì)量濃度2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)，確定其種屬來(lái)源。

1.6熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分方法的建立

以13份魚(yú)翅樣品DNA為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各1.0 μL，10 μmol/ L Taqman探針1.0 μL，DNA模版5.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序：94℃2 min；94℃10 s，60℃40 s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

1.7熒光PCR方法特異性試驗(yàn)

以市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的12份鯊魚(yú)源性樣品和9份其他魚(yú)類(lèi)樣品中提取的DNA為模板，使用上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證所建立的熒光PCR方法的特異性。

1.8熒光PCR方法靈敏度試驗(yàn)

將熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后的目的條帶割膠回收，進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定，并以此重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。將重組質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成目的基因的拷貝數(shù)。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，測(cè)定濃度后，以10倍梯度稀釋到10-10，對(duì)梯度稀釋的樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

1.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

以鯊魚(yú)陽(yáng)性對(duì)照為模板，使用本試驗(yàn)建立的方法在兩個(gè)時(shí)間段各做20次重復(fù)，通過(guò)計(jì)算Ct值的變異系數(shù)驗(yàn)證批內(nèi)及批間穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與分析

2.1魚(yú)翅樣品的普通PCR擴(kuò)增及種屬鑒定結(jié)果

13份魚(yú)翅樣品均被成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約為310 bp，與預(yù)期符合（見(jiàn)圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序，在GenBank中比對(duì)，確認(rèn)此13份魚(yú)翅樣品均為鯊魚(yú)源性，分別來(lái)自大青鯊（4份）、犁鰭檸檬鯊（2份）、黑吻真鯊、太平洋鼠鯊、錘頭雙髻鯊、淺海長(zhǎng)尾鯊、澳洲斜鋸牙鯊、白邊真鯊和鐮狀真鯊。

圖1　13份魚(yú)翅樣品PCR結(jié)果Fig.1PCR Results for 13 samples of shark’s fin

2.2熒光PCR檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分方法的建立

對(duì)已確認(rèn)為鯊魚(yú)翅的13份樣品均成功進(jìn)行了擴(kuò)增，出現(xiàn)了典型的S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照未見(jiàn)熒光增長(zhǎng)（見(jiàn)圖2）。反應(yīng)時(shí)間較普通PCR大大縮短。

圖2　13份魚(yú)翅樣品的熒光PCR結(jié)果Fig.2Fluorescent PCR results for 13 samples of shark’s fin

2.3熒光PCR方法特異性試驗(yàn)

所建立的方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的12份鯊魚(yú)源性樣品（4份新鮮鯊魚(yú)和8份魚(yú)翅樣品）可以進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而屬于其他種屬魚(yú)類(lèi)的9份樣品均未見(jiàn)熒光增長(zhǎng)（見(jiàn)圖3）。

2.4熒光PCR方法靈敏度試驗(yàn)

將8個(gè)濃度梯度的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，可檢測(cè)到的最低質(zhì)?？截悢?shù)為10拷貝/μL的數(shù)量級(jí)（見(jiàn)圖4），即為該檢測(cè)方法的靈敏度。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)兩次試驗(yàn)所獲得的Ct值用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0分析，批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.10%和1.22%，批間變異系數(shù)為1.32%，說(shuō)明20次批內(nèi)重復(fù)和2次批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果符合性較好，方法穩(wěn)定（圖5）。

3　結(jié)語(yǔ)

圖3　熒光PCR方法特異性試驗(yàn)Fig.3Specificity test for the method of fluorescent PCR

圖4　熒光PCR方法靈敏度試驗(yàn)Fig.4Sensibility test for the method of fluorescent PCR

在現(xiàn)有檢測(cè)鯊魚(yú)源性成分的方法中，PCR方法具有較高的特異性和靈敏性［13］，但需要電泳檢測(cè)，結(jié)果判讀不如實(shí)時(shí)熒光PCR方便快捷，并且開(kāi)蓋檢測(cè)存在污染的風(fēng)險(xiǎn)。SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法與普通PCR方法相比具有更高的靈敏度［14］，但是由于SYBR Green熒光染料不僅能與靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，也可以與非特異性PCR產(chǎn)物結(jié)合，理論上存在假陽(yáng)性的可能。TaqMan探針熒光PCR方法除了需一對(duì)特異性引物，還增加了一條與模版互補(bǔ)的特異性探針，探針上5'端和3'端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，每進(jìn)行一個(gè)特異性擴(kuò)增循環(huán)釋放一個(gè)分子的熒光染料，非特異性產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)信號(hào)沒(méi)有影響。因此，與SYBR Green熒光PCR方法相比，Taqman探針熒光PCR方法具有更高的特異性［15］，但其對(duì)探針的設(shè)計(jì)要求較高，需要由試驗(yàn)驗(yàn)證。作者根據(jù)GenBank中公布的鯊魚(yú)線粒體DNA（mtDNA）序列，在其高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和探針，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該引物和探針的特異性較好，對(duì)鯊魚(yú)樣品均能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并且靈敏度較高，能檢測(cè)到的最低質(zhì)?？截悢?shù)量級(jí)為10拷貝/μL。

圖5　熒光RT-PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.5Repeatability and stability test for the method of fluorescent PCR

本方法可應(yīng)用于市場(chǎng)上常見(jiàn)的鯊魚(yú)產(chǎn)品的真假鑒定，如干魚(yú)翅、泡發(fā)魚(yú)翅、鯊魚(yú)肉、鯊魚(yú)硫酸軟骨素初級(jí)加工品等。但對(duì)于部分深加工產(chǎn)品，如鯊魚(yú)肝油等，由于經(jīng)過(guò)較為復(fù)雜的加工過(guò)程，其DNA有可能被破壞或降解，應(yīng)用可能受到一定的限制。

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Detection of Shark Derived Materials by Taqman Probe Fluorescent PCR

CHEN Xuan，LIAO Xiuyun，TAO Min，LUO Baozheng*，BO Qingru，SHA Caihua，HUANG Haichao，XU Hainie，YANG Su
（State Key Quarantine Laboratory of Exotic Animal Disease，Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）

As the problem of adulteration of shark products worsens and the effective detection method lacks，this study designed a set of primers and probe based on the mitochondria DNA sequences of shark published in GenBank using the software of Primer Express 2.0，so as to establish a method of Taqman probe fluorescent PCR for the detection of shark derived materials.Results showed that 13 samples that had been identified as shark fins all displayed the amplified curves.The specificity of this method was good with all of 12 shark derived samples indicating the existence of shark DNA and with no amplification curves for the other 9 samples not derived from shark species. The detection is sensitive and the minimum detectable plasmid copy number was 10 copies/μL.It isalso rapid and simple and the results have good repeatability and stability.Therefore，the method can be applied to the identification of shark derived products in marketplaces，such as fins.

shark derived material，Taqman probe，fluorescent PCR，detection

TS 254.7

A

1673—1689（2015）10—1083—06

2014-09-17

珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局資助項(xiàng)目（ZH2013-2）。

陳軒（1983—），男，廣東梅州人，理學(xué)碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫與分子生物學(xué)檢測(cè)研究。E-mail：65561977@qq.com

羅寶正（1975—），男，山東萊西人，理學(xué)博士，研究員，主要從事動(dòng)物傳染病分子診斷研究。E-mail：bzluo@163.com