一種靶向基因操作新技術(shù)

黃俊駿　王華華　梁衛(wèi)紅

摘要：CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種細(xì)菌在噬菌體長期選擇壓力下的獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)是一段規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR），具有保護細(xì)菌免遭外源DNA入侵的功能。該系統(tǒng)成功地被改造為第三代人工核酸內(nèi)切酶，由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點，目前已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、干細(xì)胞、斑馬魚和小鼠以及植物的基因組精確修飾。CRISPR/Cas系統(tǒng)因其在結(jié)構(gòu)上的特殊性以及功能上的特異性正逐漸成為整個生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點改造分子工具?；仡櫫薈RISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史，綜述了近年來有關(guān)CRISPR系統(tǒng)的分類結(jié)構(gòu)、作用機制以及最新應(yīng)用進展，旨在為這一領(lǐng)域的科研工作提供參考。

關(guān)鍵詞：靶向基因操作；規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）；CRISPR/Cas系統(tǒng)；結(jié)構(gòu)；作用機制

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4661-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.002

Abstract：CRISPR/Cas was the elucidation of the prokaryotic adaptive immune system under bacteriophage exerted selection pressure and clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）， which protected bacteria to resist invading foreign DNA. This system was used as a gene-targeting technology to meditate multiple genome. For its easy operation，high efficiency and low cost， currently， this system was also used to modify the genome of human cell， IPS， zebra， mouse and plant by researchers and showed powerful ability to edit gene. CRISPR was becoming a hot spot in the field of bacteriology and was considered that it would replace existing technique because of the unusual structure and specific function.In this paper， we reviewed the history of CRISPR/Cas and summarized the recent research progress in the structure，classification，application and mechanism of the CRISPR. This review will provide the reference value for researchers who are interested in this new technique in their studies.

Key words：gene targeting；clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR/Cas system；structure； mechanism

隨著各種基因工程技術(shù)的深入開展，人們可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞、模式和非模式生物中進行自定義的改動，這類技術(shù)為相關(guān)研究帶來了極大的便利。研究者們能夠在這些工具的幫助下敲除基因、引入突變或者構(gòu)建融合基因，對基因有了更多的了解，以達到為生產(chǎn)實踐直接所用之目的。舉例來說，人們用酶切割特定的基因組序列，啟動細(xì)胞的修復(fù)過程，并由此作出想要的序列改變，如Meganuclease、鋅指酶和TALEN通過各自的DNA結(jié)合域來靶向目的序列。但是他們一直無法在基因組中進行精確的定位，因此不能在特定的位點進行這種基因改造。最近，簡便而又實用的基因組改造新技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)，能成功克服上述缺陷，成為這一領(lǐng)域的新寵兒。該系統(tǒng)使用RNA為核酸酶導(dǎo)航，不僅很容易設(shè)計，而且能夠改寫幾乎任何基因組序列。《Nature Methods》雜志在十周年之際推出了紀(jì)念特刊，點評了在過去十年中對生物學(xué)研究影響最深的十大技術(shù)，CRISPR赫然上榜[1]。本文回顧了CRISPR的研究歷史，對CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用機制和應(yīng)用進行了綜述，對今后該領(lǐng)域的研究進行了展望。

1 關(guān)于CRISPR研究的回顧

1987年日本課題組在對一種K12大腸桿菌編碼的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在串聯(lián)間隔重復(fù)序列，而且在該區(qū)域的兩端還存在一段不太長的特有的序列[2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在已測序的大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中都能夠觀察到這種現(xiàn)象。2002年科學(xué)家們將其正式命名為CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），即規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列[3-5]。起初，由于缺乏病毒和質(zhì)粒的序列信息，很多科研人員都認(rèn)為這種CRISPR序列是毫無價值的垃圾DNA，對CRISPR的研究進展緩慢，其行使的確切功能一直未能闡明。2005年3個生物信息學(xué)課題組報道稱，這些CRISPR的間隔序列DNA與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測CRISPR序列很有可能與細(xì)菌的免疫保護機制相關(guān)[6-8]。2006年美國研究小組通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，并提出假設(shè)，即CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能[9]。2007年Barrangou等[10]首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)改變對噬菌體的免疫力，但當(dāng)時并沒有充分意識到CRISPR機制巨大的應(yīng)用潛力。2008年，Marraffini等[11]又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實驗驗證了CRISPR系統(tǒng)的功能，由此科學(xué)家們揭開了研究CRISPR系統(tǒng)作用機制的序幕。2011年Deltcheva團隊發(fā)現(xiàn)，有一種名為tracrRNA的RNA分子與Cas9蛋白共同作用，負(fù)責(zé)生成crRNA，該成果發(fā)表在《Nature》雜志上[12]，同時推測Cas9、tracrRNA和crRNA一起能夠降解與crRNA互補的外源DNA分子。2012年，Jinek等[13]所在的課題組成功地對特定的DNA位點進行了切割。該試驗表現(xiàn)出的精準(zhǔn)的靶向特性一下子讓眾多科研人員對CRISPR技術(shù)產(chǎn)生了濃厚的興趣。2013年2月底，國際著名期刊《Cell》報道了加州大學(xué)舊金山分校的研究人員發(fā)現(xiàn)一種更精確關(guān)閉基因的方法，稱之CRISPR/Cas9介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)[14]。之后，研究者們在包括《Science》和《Nature biotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell）、斑馬魚、水稻、小麥等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾[15-18]。CRISPR/Cas基因敲除技術(shù)因其可對多種生物的基因組進行遺傳改造和在食品發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)學(xué)中的潛在價值，而且操作方法非常簡單，吸引著各國科學(xué)家們的共同關(guān)注，使其成為研究的熱點。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)

2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌在噬菌體的長期選擇壓力下，進化出的一種較為有效的獲得性免疫機制[19，20]。通過在線數(shù)據(jù)庫CRISPRdb和CRISPI的CRISPR序列信息分析發(fā)現(xiàn)，接近90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組或是質(zhì)粒中至少存在一個CRISPR基因座[21]。CRISPR是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族[21，22]，其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，通常由一個前導(dǎo)區(qū)（Leader）、多個短而高度保守的正向重復(fù)序列區(qū)（Repeat）和多個長度相似的間隔區(qū)（Spacer）組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于CRISPR簇上游，是富含AT且長度為300～500 bp的區(qū)域，這個區(qū)域一般來說在種內(nèi)是比較保守的，但在種間卻有顯著的差異[3]，被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動子序列[9]。重復(fù)序列由長度為21～48 bp的堿基組成，其平均長度在31 bp左右，由于含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)[21]。這些重復(fù)序列之間被長度為26～72 bp的間隔序列隔開[12，23]。間隔序列由俘獲的外源DNA組成[10]，形成了類似免疫記憶。當(dāng)含有同樣序列的外源DNA入侵時，可被細(xì)菌機體識別，并進行剪切使之表達沉默，達到保護自身安全的目的，為宿主細(xì)胞提供一種對抗外源基因侵染的能力。在同一個CRISPR位點中，基本上沒有相同或比較相似的間區(qū)。

通過對CRISPR簇側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在CRISPR位點附近存在著一個保守的多態(tài)性家族基因[9，24]，稱為CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated genes， Cas genes）。這些Cas基因是CRISPR免疫防御途徑中的基本組成成分，目前發(fā)現(xiàn)的Cas基因有多種類型，包括Cas1～Cas10等[25]。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)是一種雙鏈DNA核酸酶（具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性），通過位點特異性的切割將入侵DNA切斷，從而達到對自身的免疫。CAs蛋白參與CRISPR的轉(zhuǎn)錄、加工和外來基因序列的降解等過程，其基因與CRISPR共同進化，構(gòu)成一個高度保守的系統(tǒng)，進而形成特異性的防御機制，被稱為CRISPR干擾[26]。

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機制

CRISPR/Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas位點基因組織源性、參與的Cas蛋白質(zhì)和序列的不同，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I型、II型和III型[9，25，27]。I型CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas蛋白是最多和最復(fù)雜的，其中包含有特征性的Cas3蛋白，該蛋白具有解旋酶和核酸酶功能[28]，該系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)[29]。III型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含特征性的Cas10蛋白，其具有RNA酶活性[30]，主要存在于古細(xì)菌中[29]。這兩個系統(tǒng)具有相似性，即特定的Cas蛋白質(zhì)內(nèi)切酶剪切加工轉(zhuǎn)錄出的pre-crRNA，加工成熟后的crRNA與多個Cas蛋白質(zhì)形成復(fù)合體識別并剪切與crRNA互補的外源DNA雙鏈序列[12，28，31-36]。而II型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌中[29]，并且與上述兩種系統(tǒng)存在著截然不同的作用方式，而且只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈。目前II型CRISPR/Cas系統(tǒng)在研究中是最深入的，也是被改造的最為成功的人工核酸酶[10]。

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌體內(nèi)的免疫機制，其過程主要包括以下3個階段得以實現(xiàn)： 第一階段是CRISPR的高度可變的間隔區(qū)的獲得。當(dāng)細(xì)菌被外來的噬菌體或質(zhì)粒入侵時，Cas蛋白復(fù)合物識別外源基因組中的特殊片段（該特殊片段很保守，長度一般為25 bp，存在于原型間隔序列的毗鄰基序，即Protospacer-associated motif，PAM），靶向裂解和加工原型間隔序列（Protospacer），并將其整合到宿主菌基因組CRISPR位點的5′端的前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間[10]，并且每次插入活動都伴隨著重復(fù)序列的復(fù)制，也就意味著CRISPR基因座中的間隔序列從5′到3′的排列記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時間順序，為適應(yīng)性免疫奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。第二階段是CRIPSR基因座的表達（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工）。在此階段，CRISPR基因座首先會被轉(zhuǎn)錄成一段長鏈的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），這一前體將會在重復(fù)序列處被剪切，然后在Cas內(nèi)切酶的作用和tracrRNA的指導(dǎo)下被剪切加工成小RNA，也就是成熟crRNA[12，33，37-41]。通常，CRISPR基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達水平很低[37，42]，當(dāng)外源的噬菌體或是質(zhì)粒入侵宿主菌時，CRISPR的表達很快被誘導(dǎo)上調(diào)[38，39，41，43]。第三階段是CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對外源遺傳物質(zhì)的切割，該階段是CRISPR/Cas發(fā)揮抵御外源遺傳物質(zhì)入侵最關(guān)鍵的步驟。成熟的crRNA與對應(yīng)的Cas蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物，結(jié)合并掃描外源DNA，尋找crRNA的間隔序列與外源DNA互補配對的靶序列。核糖核蛋白復(fù)合體在配對的特定位置處進行切割，導(dǎo)致入侵質(zhì)?；蚴删wDNA降解。研究發(fā)現(xiàn)，間隔序列與原間隔序列只需部分互補配對也可以發(fā)生切割外源DNA[44-46]。

在細(xì)菌體內(nèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)生免疫的3個階段中，第一階段又可稱為適應(yīng)階段或信息處理階段，其作用機制在不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)中是高度保守的，Cas1和Cas2蛋白作為主要作用蛋白；第二階段的表達和第三階段的干擾可合并稱為執(zhí)行階段，該階段的作用機制在不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)中有較大的差異性，作用蛋白也有所差別[25]。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

由于II型CRISPR/Cas系統(tǒng)對靶序列的切割只需要4種成分，并且自2013年初首次報道利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細(xì)胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞的Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變之后[14]，該系統(tǒng)陸續(xù)被人們進行改造成為對各種基因組DNA進行靶向修飾的工具[13，17，47-50]。

CRISPR/Cas9技術(shù)不同于傳統(tǒng)的打靶技術(shù)，與其他基因組工程技術(shù)相比，則表現(xiàn)出許多優(yōu)越性：①CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對DNA的修飾，其基因修飾可遺傳；②無物種限制，靶向精確性更高，可輕易實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除；③實驗環(huán)節(jié)少、周期短（最快僅需2個月）、費用低和成功率高；④有可能直接得到純合子突變體。鑒于以上優(yōu)勢，該技術(shù)自發(fā)明以來迅速被廣大中外研究人員接受而廣泛應(yīng)用于研究中，成為當(dāng)今生命科學(xué)技術(shù)研究的新熱點，并且取得了可喜的結(jié)果。例如：美國馬薩諸塞州綜合醫(yī)院的研究者Mojica等利用該技術(shù)，人工合成的sgRNA（Small guide RNA）和構(gòu)建編碼Cas9的T7啟動子表達載體，通過顯微注射的方式對斑馬魚胚胎基因進行修飾，結(jié)果取得了成功。在所有被注射的斑馬魚胚胎內(nèi)10個切割位點中有8個位點都發(fā)生了切割，并且引入了插入或者缺失突變[7]；Wang等[17]將編碼Cas9蛋白的mRNA和兩條向?qū)NA分子直接注入了小鼠的受精卵細(xì)胞當(dāng)中，同樣成功地敲除了2個基因，成功率達到了80%，并且只需要數(shù)周的時間；中國科學(xué)院北京遺傳及發(fā)育生物學(xué)研究所Gao的團隊利用CRISPR技術(shù)已經(jīng)成功地讓OsPDS等4種水稻基因失活，該研究首次證實CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠用于植物的基因組編輯。隨后又利用該技術(shù)將小麥中的TaMLO基因敲除，得到了耐白粉病（powdery mildew）的小麥新品種[51]；中國科學(xué)院動物研究所的研究人員首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠的Tet1/Tet2/Tet3基因敲除，實現(xiàn)了效率高達100%的雙等位基因純合突變的單基因敲除和接近60%高效率的3個基因同時敲除大鼠，并且證明CRISPR/Cas系統(tǒng)引入的基因修飾可通過生殖細(xì)胞傳遞到下一代，該技術(shù)可推動基因修飾大鼠成為重要的動物模型[52]；中國科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所朱健康實驗室用CRISPR/Cas系統(tǒng)分別對擬南芥BRI1、JAZ1、GAI基因和水稻ROC5、SPP、YSA基因進行了定點突變，在擬南芥和水稻中分別采用各自的啟動子（CaMV 35S和AtU6-26、CaMV 35S和OsU6-26）表達Cas9基因和gRNA（guide RNA），結(jié)果表明CRISPR/Cas系統(tǒng)可以精準(zhǔn)地產(chǎn)生位點特異性雙鏈DNA斷裂及較高的突變效率，且在T1代獲得了純合突變體[15]；Platt等[53]最近又構(gòu)建出了一種新的小鼠模型，簡化了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)基因組編輯實驗中的應(yīng)用，并且構(gòu)建出了最致命的一種人類癌癥——肺腺癌的模型；華東師范大學(xué)的研究人員通過將RNA直接注入到單細(xì)胞胚胎中，利用CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建出了多個基因突變的大鼠品系，證實在大鼠中Cas9能夠高效地介導(dǎo)基因編輯，同時生成復(fù)合基因突變體模型[54]。

當(dāng)然，CRISPR技術(shù)也不是盡善盡美的，也存在一定的局限和缺陷。比如我們現(xiàn)在就不清楚向?qū)NA分子的特異性作用機制。據(jù)美國波士頓市麻省總醫(yī)院的Hwang等介紹，他們的原始試驗數(shù)據(jù)顯示，CRISPR技術(shù)也存在明顯的脫靶效應(yīng)[16]。同時CRISPR/Cas9對基因組DNA剪切的準(zhǔn)確性還有待系統(tǒng)性的評估，如何設(shè)計出低脫靶效應(yīng)，高精準(zhǔn)度的CRISPR/Cas系統(tǒng)將是未來研究的重點。

4 展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)作為一種新型打靶技術(shù)，相比其他的基因打靶技術(shù)來說具有更多的優(yōu)勢，技術(shù)的簡便、易用特性以及無限的應(yīng)用潛力，特別是由其介導(dǎo)的遺傳疾病治療研究為人類基因治療提供了一條新的思路。當(dāng)然，今后的研究還需要避免脫靶現(xiàn)象，進一步提高治愈率。同時在整個實驗過程中不涉及外源DNA的整合，也就避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來的生物安全問題，因此在動植物新品種培育，尤其是轉(zhuǎn)基因動物的制備中，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)也將有很大的作為。除此之外，CRISPR技術(shù)還有很多其他非常有價值的應(yīng)用方向。根據(jù)實際遺傳學(xué)操作的需要，CRISPR技術(shù)會找到屬于它們自己的一席之地。就像Briner等[55]認(rèn)為的那樣，目前CRISPR技術(shù)面臨的瓶頸就是人類的想象力太有限了。由此看來，細(xì)菌受感染之后啟動的這套機制為基因工程的研究提供了非常有價值的參考。

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