熒光碳點(diǎn)在脊椎類模式動(dòng)物斑馬魚中的活體成像與毒理學(xué)研究

鄧 帥，李雨珊，段延芳，李 麗*，安利民*，鄭 敏，李炳生，吳 瓊，孫再成

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080；3.發(fā)光學(xué)及應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長(zhǎng)春 130033；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與交叉科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150080）

文章編號(hào)：1000-7032（2015）04-0485-06

熒光碳點(diǎn)在脊椎類模式動(dòng)物斑馬魚中的活體成像與毒理學(xué)研究

鄧 帥1，李雨珊1，段延芳2，李 麗1*，安利民2*，鄭 敏3，李炳生4，吳 瓊1，孫再成3

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080；3.發(fā)光學(xué)及應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長(zhǎng)春 130033；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與交叉科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150080）

將熒光碳點(diǎn)引入透明斑馬魚胚胎中，研究了熒光碳點(diǎn)在斑馬魚中的活體成像和對(duì)斑馬魚的毒副作用。通過對(duì)水中添加熒光碳納米顆粒，從形態(tài)上觀察其對(duì)于斑馬魚個(gè)體發(fā)育的生物學(xué)效應(yīng)，實(shí)時(shí)觀察其在斑馬魚體內(nèi)富集代謝的情況，為熒光碳點(diǎn)及其復(fù)合物在生物活體成像方面的研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，熒光碳點(diǎn)對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯的毒副作用，不會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常（通過觀察尾巴彎曲情況、色素深淺、血管發(fā)育速度、魚鰾發(fā)育速度來(lái)確定對(duì)胚胎發(fā)育的影響），并且對(duì)斑馬魚無(wú)明顯致死現(xiàn)象。熒光碳點(diǎn)進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)的時(shí)間非常迅速，并且可以在48 h之內(nèi)經(jīng)代謝排出體外。

斑馬魚；熒光碳點(diǎn)；胚胎發(fā)育；生物毒性

1 引 言

熒光納米粒子在生物成像、藥效監(jiān)測(cè)和腫瘤治療等方面有著潛在的應(yīng)用前景［1-3］。為了實(shí)現(xiàn)這些功能，需要把納米粒子直接注入到生物體內(nèi)，這樣就必須首先了解這些納米粒子對(duì)生物體的影響和在生物體內(nèi)完整的代謝過程［4-5］。但是，對(duì)于許多半導(dǎo)體量子點(diǎn)，由于尺寸、表面效應(yīng)或者含有重金屬等原因，實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)證明其對(duì)人類健康存在著負(fù)面影響［6-8］。熒光碳量子點(diǎn)（碳點(diǎn)）是碳家族繼碳納米管、石墨烯、富勒烯之后的新成員，一出現(xiàn)便引起了廣泛的關(guān)注［9-10］。碳點(diǎn)具有分子量小、熒光穩(wěn)定性高、激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜連續(xù)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)。此外，因?yàn)橹饕煞质翘?，因而被認(rèn)為具有生物相容性好且毒性低等特點(diǎn)，是生物標(biāo)記和熒光成像等醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想材料。經(jīng)過近十年的努力，人們已經(jīng)在碳點(diǎn)的制備和應(yīng)用研究上取得了顯著的進(jìn)步。

要使碳點(diǎn)能夠發(fā)光且發(fā)光波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)，首先必須對(duì)其表面進(jìn)行特殊的修飾。光電子能譜實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過修飾的碳點(diǎn)表面存在著C—N、C—O、C＝O和N—H化學(xué)鍵，表明這種發(fā)光碳點(diǎn)的表面非常復(fù)雜［11］。納米顆粒的性質(zhì)與其表面特性有關(guān)，而經(jīng)過修飾的碳點(diǎn)有沒有生物毒性還不清楚。目前大部分實(shí)驗(yàn)是在老鼠表皮組織中進(jìn)行成像和藥物診斷等方面的嘗試，而對(duì)于碳點(diǎn)自身對(duì)生物體的影響還沒有系統(tǒng)的研究。針對(duì)這個(gè)問題，我們引入了斑馬魚生物模型，研究了碳點(diǎn)對(duì)它的生物學(xué)影響。斑馬魚具有產(chǎn)卵數(shù)目多、魚卵容易收集篩選、胚胎透明易于觀察、靈敏度高和易重復(fù)等特點(diǎn)，是研究生態(tài)毒理性實(shí)驗(yàn)的一種重要的模式動(dòng)物［12］。利用斑馬魚透明和碳點(diǎn)發(fā)光的特點(diǎn)，我們用光直接激發(fā)進(jìn)入到魚體內(nèi)的碳點(diǎn)，觀察到了碳點(diǎn)在受精卵、活體內(nèi)不同部位的熒光。本文系統(tǒng)研究了碳點(diǎn)從進(jìn)入斑馬魚受精卵和斑馬魚活體體內(nèi)、在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)以及最后排出受精卵和體外的整個(gè)生物循環(huán)過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明熒光碳點(diǎn)對(duì)斑馬魚受精卵和活體生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯的毒副作用，不會(huì)可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，也不會(huì)對(duì)斑馬魚的不同生理過程產(chǎn)生毒害作用，對(duì)斑馬魚無(wú)明顯致死現(xiàn)象。熒光CDs進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)的時(shí)間非常迅速，并且可以經(jīng)代謝排出體外。這也直接證明了CDs可以安全應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的生物成像和藥物監(jiān)測(cè)等方面。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 熒光碳點(diǎn)的制備和提純

熒光碳點(diǎn)的制備方法見參考文獻(xiàn)［11］。在進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)之前，先對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行提純處理：取碳點(diǎn)粗產(chǎn)物2 mL，加入丙酮后離心，分離得到產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物重新溶入少量水中，加入丙酮，再次離心，純化；將其溶于水后轉(zhuǎn)入截留分子量為1 500 u的透析袋中，每隔4 h換一次水，進(jìn)行透析。24 h后，使用PBS調(diào)節(jié)pH值為7，然后配成不同濃度的碳點(diǎn)溶液，分別對(duì)斑馬魚受精卵和幼魚進(jìn)行處理，觀察碳點(diǎn)在受精卵和幼魚中的代謝情況和毒理實(shí)驗(yàn)。

2.2 碳點(diǎn)的代謝特性實(shí)驗(yàn)

配成碳點(diǎn)濃度為0，50，100，200，400 μg/mL的溶液各4 mL，加入6孔培養(yǎng)皿中，選取受精后3 h的斑馬魚魚卵開始染毒實(shí)驗(yàn)，每孔20只，每隔24 h更換液體，并進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。選用濃度為0，25，50，100 μg/mL的溶液，每組溶液中培養(yǎng)20只孵化5 d的幼魚，染毒處理1.5 h后用E3培養(yǎng)液洗3次，然后在熒光顯微鏡460 nm波長(zhǎng)照射光下觀察幼魚發(fā)光及代謝情況，隨后在24 h和48 h時(shí)再次在熒光顯微鏡下觀察幼魚發(fā)光情況。

2.3 斑馬魚毒理實(shí)驗(yàn)（孵化率，心率，自主運(yùn)動(dòng)，畸形統(tǒng)計(jì)）

取濃度為0，25，50，100，200，400 μg/mL的溶液，加入6孔培養(yǎng)皿中，選取受精后3 h的斑馬魚魚卵開始染毒實(shí)驗(yàn)，每孔18只。在產(chǎn)卵24 h后，每隔3 h統(tǒng)計(jì)魚的孵化率，直到魚全部孵化為止。在魚產(chǎn)卵24 h時(shí)統(tǒng)計(jì)魚卵的自主運(yùn)動(dòng)（即魚卵中的幼魚在1 min內(nèi)的擺尾次數(shù)）情況，每組取9只魚卵。在魚產(chǎn)卵48 h時(shí)統(tǒng)計(jì)幼魚的心率，每組取5只幼魚。最后，統(tǒng)計(jì)魚的畸形率。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光碳點(diǎn)在斑馬魚受精卵內(nèi)和幼魚體內(nèi)的代謝特性

含有重金屬的納米粒子進(jìn)入到生物體后一般會(huì)沉積到體內(nèi)，很難排出體外，這也成了限制納米粒子在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的主要障礙。因?yàn)樘键c(diǎn)的一個(gè)重要應(yīng)用是生物成像，所以有必要了解它進(jìn)入生物體內(nèi)的代謝特性。利用斑馬魚透明和碳點(diǎn)發(fā)光的特點(diǎn)，我們?cè)诠庹盏臈l件下，觀察了碳點(diǎn)在受精卵和幼魚中的動(dòng)態(tài)代謝情況。

碳點(diǎn)進(jìn)入卵或魚體內(nèi)后，在365 nm光激發(fā)下，將發(fā)出藍(lán)色光（～465 nm）。我們用不同濃度的碳點(diǎn)溶液對(duì)斑馬魚受精卵處理1.5 h，然后取出洗凈，置于純水中。圖1為不同靜置時(shí)間下的熒光碳點(diǎn)的代謝情況。從對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出，溶液中存在的碳點(diǎn)可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中（0 h是指細(xì)胞卵被洗凈后，立刻進(jìn)行觀察）。隨著碳點(diǎn)濃度的增加，細(xì)胞的發(fā)光亮度也增大，說明進(jìn)入細(xì)胞的碳點(diǎn)數(shù)量增多。在魚卵表面，存在一些發(fā)光的大顆粒（見圖1底部左圖和右圖）。通過白光觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)亮點(diǎn)處是一些碳點(diǎn)的富集。而之所以富集，是由于細(xì)胞膜受損或壞死所致，并且即使通過多次洗滌，也很難除去。然后，把魚卵靜置在純水中24 h，再進(jìn)行熒光觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)溶液濃度為25 μg/mL實(shí)驗(yàn)組碳點(diǎn)已完全代謝出魚體外，濃度為50，100 μg/mL實(shí)驗(yàn)組碳點(diǎn)還略有殘留。等到靜置48 h后，100 μg/mL實(shí)驗(yàn)組的受精卵中也觀察不到碳點(diǎn)，說明碳點(diǎn)可進(jìn)入斑馬魚卵內(nèi)富集且能正常代謝出來(lái)。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)容易富集在細(xì)胞膜損傷處或壞死點(diǎn)，且難以洗掉，這一點(diǎn)可以從白光與熒光的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中看出。還有一點(diǎn)值得注意，從圖中可以發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，但是很難進(jìn)入到細(xì)胞核中。

圖1 熒光碳點(diǎn)在斑馬魚受精卵中的發(fā)光與代謝情況。24 h后，25 μg/mL碳點(diǎn)處理的魚體內(nèi)的碳點(diǎn)已經(jīng)被排除體外。細(xì)胞膜損壞部位容易引起碳點(diǎn)的富集。

用不同濃度的碳點(diǎn)溶液處理1.5 h后，取出在純水中靜置不同時(shí)間后的斑馬魚幼魚的熒光成像如圖2所示。從圖中可以看出，隨著用于處理的碳點(diǎn)濃度的增加，發(fā)光亮度增大，說明進(jìn)入到體內(nèi)的碳點(diǎn)增多。從圖中還可以看到，在水中加入碳點(diǎn)來(lái)處理斑馬魚，碳點(diǎn)主要富集在口、鰓部和內(nèi)臟等處，并無(wú)進(jìn)入血液循環(huán)。隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)（48 h），斑馬魚幼魚能將從水中吸入的碳點(diǎn)完全排出體外。而我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些納米粒子如二氧化硅小顆粒等，容易沉積在生物體內(nèi)，無(wú)法排出體外，并且會(huì)引起一些嚴(yán)重的疾病。

圖2 用不同濃度的碳點(diǎn)溶液處理斑馬魚后，碳點(diǎn)在魚體內(nèi)的代謝情況。利用碳點(diǎn)的發(fā)光特性，可以看出48 h后，碳點(diǎn)可以經(jīng)過代謝排出體外。

3.2 熒光碳點(diǎn)在斑馬魚受精卵內(nèi)和幼魚體內(nèi)的毒理實(shí)驗(yàn)

圖3 斑馬魚卵在碳點(diǎn)溶液中存活率統(tǒng)計(jì)

圖4 斑馬魚受精卵在各濃度熒光碳點(diǎn)溶液中的孵化率

從圖1中可知，碳點(diǎn)會(huì)進(jìn)入到受精卵中，因而有可能對(duì)生命活動(dòng)有影響。我們首先研究了不同碳點(diǎn)濃度的水溶液中，斑馬魚受精卵的存活率和孵化率。提純后的碳點(diǎn)配制成濃度為0，50，100，200，400 μg/mL的溶液，每組溶液中培養(yǎng)20只受精卵，持續(xù)168 h觀察它們的存活率。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果總結(jié)在圖3中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組并無(wú)明顯區(qū)別。為了進(jìn)一步了解碳點(diǎn)濃度對(duì)受精卵的影響，在此基礎(chǔ)上，我們又進(jìn)行了更大濃度的實(shí)驗(yàn)，碳點(diǎn)濃度分別為0，500，1 000，2 000 μg/mL，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仍無(wú)差別，僅有少數(shù)個(gè)體死亡，但這是少數(shù)受精卵無(wú)法正常生長(zhǎng)發(fā)育的正?，F(xiàn)象。圖4是斑馬魚受精卵在不同濃度的碳點(diǎn)溶液中的孵化率。受精卵經(jīng)過35 h開始孵化成幼魚。從圖中可以看出，即使在濃度很高的碳點(diǎn)溶液中，受精卵的孵化率也未受到影響?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論：碳點(diǎn)具有良好的生物相容性，對(duì)斑馬魚的受精卵沒有明顯的致死、致畸等不良作用，也不影響其孵化率。

在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們研究了碳點(diǎn)濃度對(duì)斑馬魚的自主運(yùn)動(dòng)和心率的影響。圖5是斑馬魚在不同濃度的碳點(diǎn)溶液中的自主運(yùn)動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)表明，熒光碳點(diǎn)對(duì)斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)的頻率影響不大。在0～400 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，自主運(yùn)動(dòng)基本不受碳點(diǎn)濃度的影響。圖6是不同濃度的碳點(diǎn)溶液對(duì)斑馬魚心率的影響。從圖中可以看出，熒光碳點(diǎn)對(duì)斑馬魚心率影響不大，在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。

圖5 斑馬魚在各濃度熒光碳點(diǎn)溶液中的自主運(yùn)動(dòng)情況

圖6 斑馬魚在各濃度熒光碳點(diǎn)溶液中的心率情況

圖7是斑馬魚在不同濃度的碳點(diǎn)溶液中發(fā)生的畸形率。從圖中可以看出，不同濃度的碳點(diǎn)溶液對(duì)斑馬魚實(shí)驗(yàn)組的畸形率影響不大，100 μg/ mL濃度的碳點(diǎn)溶液產(chǎn)生的畸形率最高，但也沒有超過12%，說明熒光碳點(diǎn)的致畸率較低。從圖1、3、4可知，碳點(diǎn)能夠進(jìn)入到受精卵內(nèi)，但并不影響受精卵的存活率和孵化率，對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育這個(gè)階段影響較小。而從圖2、5、6、7可知，碳點(diǎn)可以進(jìn)入到斑馬魚體內(nèi)，但并不能通過滲透進(jìn)入到斑馬魚的血液循環(huán)系統(tǒng)，因而需要進(jìn)一步研究碳點(diǎn)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，對(duì)斑馬魚生理活動(dòng)的影響。目前，把碳點(diǎn)注射到斑馬魚的血管中的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行當(dāng)中。從圖7可知，碳點(diǎn)也能引起少量的畸形。通過顯微鏡觀察了不同碳點(diǎn)溶液中畸形的特征，如圖8所示。在濃度為50 μg/mL的碳點(diǎn)溶液中，斑馬魚出現(xiàn)了心竇水腫和脊椎彎曲兩種畸變現(xiàn)象；而在100，200，400 μg/mL的碳點(diǎn)溶液中，斑馬魚出現(xiàn)的畸形均為脊椎彎曲。在現(xiàn)階段，我們對(duì)碳點(diǎn)導(dǎo)致畸形的原因還不清楚。

圖7 斑馬魚在各濃度熒光碳點(diǎn)溶液中的畸形率

圖8 畸形斑馬魚與正常魚的對(duì)照。碳點(diǎn)會(huì)引起心竇水腫和脊柱彎曲等畸形。

4 結(jié) 論

系統(tǒng)研究了不同濃度的碳點(diǎn)溶液對(duì)斑馬魚受精卵和幼魚的影響。熒光碳點(diǎn)在受精卵和斑馬魚中仍然能夠發(fā)光，并且比較穩(wěn)定。碳點(diǎn)對(duì)生物系統(tǒng)沒有毒性，對(duì)生物各項(xiàng)生理指標(biāo)影響較小，在體內(nèi)代謝快，不會(huì)長(zhǎng)期積累。由于熒光碳點(diǎn)具有低毒性及制造成本低的優(yōu)點(diǎn)，所以其代替目前所使用的用于生物研究的標(biāo)記物有很大的可行性。

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鄧帥（1993-），男，四川江油人，哈爾濱工業(yè)大學(xué)本科在讀，主要從事生物技術(shù)方面的研究。

E-mail：627884373@qq.com

李麗（1977-），女，內(nèi)蒙古通遼人，博士，副教授，2010年于日本筑波大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

E-mail：lilili@hit.edu.cn

安利民（1979-），男，黑龍江富裕縣人，副教授，2010年于哈爾濱工業(yè)大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事熒光量子點(diǎn)方面的研究。

E-mail：alm59@126.com

Flourescent Imaging and Toxicology Study of Carbon Dots in Transparent Zebrafishes

DENG Shuai1，LI Yu-shan1，DUAN Yan-fang2，LI Li1*，AN Li-min2*，ZHENG Min3，LI Bing-sheng4，WU Qiong1，SUN Zai-cheng3

（1.School of Life Science and Technology，Harbin Institute of Technology，Harbin 150080，China；2.College of Physics Science and Technology，Heilongjiang University，Harbin 150080，China；3.State Key Laboratory of Luminescence and Applications，Changchun Institute of Optics，F(xiàn)ine Mechanics and Physics，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130033，China；4.Academy of Fundamental and Interdisciplinary Sciences，Harbin Institute of Technology，Harbin 150080，China）
*Corresponding Authors，E-mail：lilili@hit.edu.cn；alm59@126.com

In this paper，we introduce the carbon dots（CDs）into transparent embryos of zebrafishes and study the fluorescent imaging and toxicology of CDs.With immerging oosperms and infants of zebrafishes into the aqueous solution of CDs for 1.5 h，the CDs go through the cell membrane and emerge inside of them.Then，from the morphological，we study the biological effects on the individual development and in vivo observe the supersession of zebrafishes.We demonstrate that CDs have no apparent toxicity on the growing development and do not induce the development abnormity of embryo.Furthermore，the CDs do not lead to the death of zebrafishes.We also find that CDs can enterinto the zebrafisher rapidly and be expelled from the body within 48 h.

zebrafishes；carbon dots；embryonic development；biotoxicity

O482.31

A DOI：10.3788/fgxb20153604.0485

2015-01-05；

2015-02-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（21403061，11474076）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)基金（LBH-Q13082）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2013M541420）；黑龍江大學(xué)學(xué)科青年學(xué)術(shù)骨干百人支持計(jì)劃；新教師基金（20132302120069）資助項(xiàng)目