硝酸銀-硅膠柱層析法分離純化核桃油中亞麻酸工藝研究

張衛(wèi)民，翟元春，楊紅軍，張潤光，郝　劍，韓軍岐，張有林，*

（1.西安市林業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西西安710061；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

硝酸銀-硅膠柱層析法分離純化核桃油中亞麻酸工藝研究

張衛(wèi)民1，翟元春2，楊紅軍1，張潤光2，郝劍1，韓軍岐2，張有林2，*

（1.西安市林業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西西安710061；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

先采用尿素包合法對核桃油中脂肪酸進(jìn)行初步分離，在此基礎(chǔ)上利用硝酸銀-硅膠柱層析法對核桃油中亞麻酸進(jìn)一步純化，20g硅膠中與2g AgNO3配制成硝酸銀硅膠柱中，加入與吸附劑比例為1∶15的經(jīng)尿素包合后富集得到的脂肪酸，洗脫劑流速為0.6mL/min，丙酮-石油醚濃度為8%時，核桃油中亞麻酸由原來的8.7%洗脫后提高到95.9%，以上結(jié)果表明硝酸銀-硅膠柱層析法是一種高效分離亞麻酸的方法。

核桃油，硝酸銀-硅膠，亞麻酸

核桃仁富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物元素，脂肪含量達(dá)60%～70%［1］，核桃油中不飽和脂肪酸含量明顯高于一般食用油［2］。核桃油中含有的亞油酸和亞麻酸是人體必需脂肪酸，其中亞麻酸被稱作“21世紀(jì)綠色營養(yǎng)保健食品”［3］，具有清除血液中甘油三酯，降低內(nèi)源性TC合成的作用。在去飽和酶和碳鏈延長酶作用下，亞麻酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧幔?0∶6，Docosahexaenoic Acid，DHA）和二十碳五烯酸（20∶5，Eicosapentenoic acid，EPA），這兩種脂肪酸均具有降血脂，增強大腦機能，預(yù)防動脈粥樣硬化的功效［4-6］。

目前分離不飽和脂肪酸的方法主要有：尿素包合法、超臨界流體萃取法、分子蒸餾法、銀離子配位法、吸附分離法等，其中吸附分離法中的硝酸銀-硅膠柱法具有易操作、設(shè)備簡單等優(yōu)點。與尿素包合法相比，硝酸銀-硅膠柱法具有進(jìn)一步分離純化脂肪酸的作用，尤其對碳鏈數(shù)目相近的不飽和脂肪酸分離效果甚為明顯。硝酸銀-硅膠柱層析法屬絡(luò)合層析，其基本原理是利用吸附在硅膠上的銀離子與不飽和脂肪酸中的-C=C-發(fā)生電子遷移形成π絡(luò)合物，通過改變各飽和度不同的脂肪酸在吸附劑上的分配系數(shù)，從而實現(xiàn)分離［7-9］。近幾年，國內(nèi)外已多次使用硝酸銀-硅膠柱法分離動植物油中多不飽和脂肪酸及其甲酯，但未見其在核桃油中的應(yīng)用。本實驗以硝酸銀-硅膠H為吸附劑，研究了硝酸銀-硅膠柱層析法中幾個重要因素對核桃油中亞麻酸分離純化的影響，為從核桃油中分離亞麻酸提供技術(shù)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試核桃品種為香菱，由西安市核桃種質(zhì)資源圃提供；核桃油由香菱核桃品種取仁采用冷榨法制得；尿素、無水硫酸鈉、95%乙醇、石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、丙酮、甲醇、硫酸、氫氧化鉀、鹽酸等均為分析純，由天津市天力化學(xué)試劑有限公司提供；異辛烷為色譜純；棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸混合甲酯標(biāo)準(zhǔn)品由美國Sigma公司提供，純度＞99.6%。

氣相色譜儀（TRACE2000，ThermoFisher Scientific，USA）配備火焰離子化檢測器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID），美國菲尼根公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上海安亭實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1脂肪酸混合液制備參照文獻(xiàn)［10］中的方法，稱取50g核桃油于燒瓶中，加入200mL 4%的氫氧化鉀-95%乙醇溶液，用磁力攪拌器緩慢攪拌升溫至75℃，皂化回流2h至皂化完全。加入一定量溫水，繼續(xù)攪拌30min使其皂化物充分溶解，在上述反應(yīng)液中緩慢加入20%的鹽酸調(diào)節(jié)pH約為2，恒溫攪拌15min，分液漏斗分離出油層，加入200mL石油醚溶解，并用40℃溫水洗滌有機層至中性，加入10g無水硫酸鈉脫水，過濾，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得脂肪酸混合液，稱取重量。

1.2.2尿素包合法純化核桃油中亞麻酸參考文獻(xiàn)［11］中的方法。

1.2.3硝酸銀化硅膠柱層析法純化核桃油中亞麻酸硝酸銀化硅膠制備：參考文獻(xiàn)［12］中方法，稍作修改。

以丙酮-石油醚作為洗脫劑，設(shè)計尿素包合后脂肪酸上樣量與硝酸銀-硅膠吸附劑用量之間比例為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，依次用0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%丙酮-石油醚混合溶液100mL進(jìn)行洗脫（注：1%指100mL洗脫液中含有1mL丙酮和99mL石油醚），控制流速，每25mL收集一次洗脫液，洗脫流速設(shè)計為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL/min。

1.2.4氣相色譜分析脂肪酸甲酯化［13］：取脂肪酸樣品0.1g于燒瓶中，向其中加入2mL 1%硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴鍋中甲酯化30min。給經(jīng)甲酯化的脂肪酸樣品中加入2mL色譜純異辛烷，倒入適量蒸餾水至瓶頸處，靜止分層，取異辛烷層進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：使用HP-INNOWAX石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.32mm×0.25μm）；采用程序升溫模式，起始溫度140℃，保持5min，后以4℃/min升至220℃，保持15min；進(jìn)樣口溫度260℃，檢測器溫度280℃；以氮氣為載氣，流速1.0mL/min；分流進(jìn)樣，分流比20∶1，進(jìn)樣量1μL，檢測器為FID，利用面積歸一法求出各組樣品中亞麻酸的純度。

2　結(jié)果與分析

2.1尿素包合前后核桃油中脂肪酸組成

通過前期大量實驗最終確定包合工藝條件為：包合時間為24h，包合溫度為-10℃，m1（混合脂肪酸）∶m2（尿素）為0.3，V（95%乙醇）∶m2（尿素）為4，經(jīng)過一次尿素包合分離純化使得核桃油中亞麻酸含量由原來的8.7%提高為19.5%。冷榨后的核桃油，尿素包合前與包合后分別測定了脂肪酸的組成，結(jié)果見表1。

表1　尿素包合前后核桃油中脂肪酸組成Table 1　The fatty acid composition of walnut oil before and after the urea inclusion

由表1可知，冷榨核桃油主要由五種脂肪酸組成，其中棕櫚酸8.1%，硬脂酸2.9%，油酸28.1%，亞油酸52.1%，亞麻酸8.7%，尿素包合后亞油酸、亞麻酸得到了富集，相對含量分別提高到了80.2%和19.5%。飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸含量降至最低。用尿素包合法初步分離核桃油中飽和程度不同的脂肪酸效果良好。

2.2硝酸銀硅膠柱層析法分離純化核桃油中亞麻酸條件優(yōu)化

2.2.1最佳上樣量確定以核桃油中亞麻酸相對含量作為指標(biāo)，固定洗脫濃度為6%，流速為0.4mL/min，確定最佳上樣量，結(jié)果見圖1。由圖1看出，隨著上樣量與吸附劑比例的增加，亞麻酸含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。上樣量逐漸增多，樣品與吸附劑間作用逐漸增強。當(dāng)上樣量與吸附劑的比例達(dá)到適當(dāng)過載的最佳狀態(tài)1∶15時，核桃油中亞麻酸含量明顯高于其他比例（p＜0.05），達(dá)到82.5%，之后柱效均有所下降（p＞0.05）。這些差異主要是由于層析柱分離效果所決定。當(dāng)上樣量不足時，樣品中脂肪酸濃度較低，擴散作用對傳質(zhì)的影響相對較大，柱效分離低。當(dāng)樣品過載程度過大，影響柱子的分離效果，降低體系中亞麻酸的含量?？紤]到實驗要求和硝酸銀成本問題，最終選定上樣量與吸附劑比例1∶15為佳。

圖1　上樣量與吸附劑比例對亞麻酸含量的影響Fig.1　Sample amount and proportion of adsorbent on the influence of linolenic acid content

2.2.2不同濃度洗脫劑對亞麻酸純度的影響選取上樣量為1∶15，流速為0.4mL/min，不同濃度洗脫液體積洗脫得到的脂肪酸含量見表2。由表2看出，用0%～2%洗脫液，樣品中亞油酸和亞麻酸基本未被洗脫。用3%洗脫液75mL時亞油酸開始被大量洗出，亞麻酸洗脫極少。洗脫液濃度為5%時亞油酸洗脫基本完成，亞麻酸開始被大量洗脫，繼續(xù)加大洗脫液濃度，被洗脫下的亞麻酸含量逐漸增加，當(dāng)用濃度為8%洗脫液75mL時亞麻酸洗脫完畢。

圖2為不同濃度洗脫液洗脫時，樣品中亞麻酸和亞油酸相對含量洗脫曲線圖。

表2　不同濃度和用量丙酮-石油醚洗脫結(jié)果Table 2　Different concentration and dosage of acetone and petroleum ether elution result

圖2　不同濃度丙酮-石油醚液對核桃油中亞油酸、亞麻酸洗脫曲線Fig.2　The elution curves of linoleic acid and linolenic acid in walnut oil under the influence of the different concentration of acetone-petroleum

由圖2看出，當(dāng)洗脫液濃度為3%時，亞油酸開始被大幅度洗脫下來，曲線開始明顯呈上升趨勢，而此時亞麻酸基本未被洗脫。洗脫液濃度為4%時，亞油酸大部分被洗脫下，亞麻酸開始洗脫，洗脫液中亞麻酸的相對含量隨著洗脫液濃度增加而不斷提高。亞油酸在洗脫液濃度為5%時基本被洗脫完全，洗脫液濃度為8%時亞麻酸全部被洗脫下來，洗脫液中亞麻酸含量高達(dá)95.8%。脂肪酸的極性隨著雙鍵個數(shù)的增多而增大，亞油酸為十八碳二烯酸，低濃度洗脫劑即可將其洗脫下來，亞麻酸為十八碳三烯酸，高濃度的洗脫劑可有效地將其洗脫下來，兩種濃度洗脫劑存在明顯分割點，使用梯度濃度洗脫可將不同脂肪酸很好地分離開來。

2.2.3最佳流速的確定選取上樣量為1∶15，洗脫濃度為8%，以洗脫液中亞麻酸的相對含量作為指標(biāo)，研究不同流速對實驗的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　洗脫劑流速對亞麻酸含量的影響Fig.3　The influence of eluent velocity of linolenic acid content

由圖3可以看出，在不同的洗脫劑流速下，洗脫液中亞麻酸含量不同，隨著洗脫流速的增加，亞麻酸的相對含量整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)洗脫流速達(dá)到0.6mL/min時亞麻酸相對含量顯著高于其他洗脫流速下的亞麻酸相對含量（p＜0.05），當(dāng)洗脫流速為0.4、0.8、1.0mL/min時差異不顯著（p＞0.05）。依據(jù)吸附理論，樣品中的組分與固定相表面的活性位會產(chǎn)生親和作用而吸附到固定相上。較低流速時，樣品在軸向的擴散速度變大，使得樣品縱向的速度小于軸向洗脫速度，使得部分洗脫物擴散，洗脫液中亞麻酸含量減少。但洗脫流速過快，則固定相與流動相之間難以建立分離平衡，影響洗脫效果，通過實驗分析得出，當(dāng)洗脫劑流速0.6mL/min時，亞麻酸含量為86.4%，效果最佳。

2.3洗脫液氣相色譜分析結(jié)果

將硝酸銀硅膠柱對亞麻酸的分離純化效果用氣相色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4、圖5和表3。由圖4、圖5可以看出，經(jīng)硝酸銀硅膠柱分離純化，亞麻酸純度得到了極大提高。由表3看出，油脂中亞麻酸的相對含量由冷榨油中的8.7%提高到了95.9%。

圖4　脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.4　Fatty acids standard by gas chromatogram

圖5　柱層析后樣品脂肪酸氣相色譜圖Fig.5　After column chromatography of samples of fatty acids by gas chromatogram

表3　脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和層析后樣品脂肪酸組成Table 3　The composition of standard fatty acid and after column chromatography of samples fatty acid

3　結(jié)論

先用尿素包合法使亞麻酸的相對含量由冷榨油的8.7%上升到了19.5%。在20g硅膠中與2g AgNO3配制成硝酸銀硅膠柱中，加入與吸附劑比例為1∶15的經(jīng)尿素包合后富集得到的脂肪酸，控制洗脫劑流速為0.6mL/min，在洗脫液濃度為8%時，洗脫完畢洗脫液中亞麻酸的含量達(dá)到95.8%，與冷榨核桃油相比，純度提高了87.1%，通過尿素包合法與硝酸銀化硅膠聯(lián)合應(yīng)用使核桃油中亞麻酸的純度得到大幅度提高，該方法簡單易行，可大規(guī)模分離純化亞麻酸。

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Silver nitrate-silica gel column chromatography purification linolenic acid in the walnut oil

ZHANG Wei-min1，ZHAI Yuan-chun2，YANG Hong-jun1，ZHANG Run-guang2，HAO Jian1，HAN Jun-qi2，ZHANG You-lin2，*
（1.Forestry Technology Promotion Center of Xi’an，Xi’an 710061，China；2.Shaanxi Normal University Food Engineering and School of Nutrition Science，Xi’an 710119，China）

The fatty acids of walnut oil were separated primarily by urea adduction method，then the linolenic acid of walnut oil was further purified by silver nitrate-silica gel column chromatography.In the silver silica gel column formed by 20g silica gel and 2g AgNO3，join in the ratio was 1∶15 with adsorbent after urea inclusion enrichment of fatty acids，100mL 8%acetone-petroleum，underd the elution flow rate of 0.6mL/min，the content of linoleic acid in walnut oil increased from the original 8.7%to 95.9%.This suggests that the silver nitrate-silica gel column chromatography is a kind of high efficient separation method of linolenic acid.

walnut oil；silver nitrate-silica gel；linoleic acid

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0229-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.039

2014－08－14

張衛(wèi)民（1969-），男，碩士研究生，工程師，主要從事林業(yè)技術(shù)推廣與林產(chǎn)品加工方面的研究。

張有林（1956-），男，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

中央財政林業(yè)科技推廣示范跨區(qū)域重點推廣示范項目（2011TK109）；西安市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新計劃項目（NC1317.3）。