柱前衍生化高效液相色譜法分析發(fā)菜胞外多糖的單糖組成

王貴春，陳雪峰，劉　寧，王　寧

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021）

柱前衍生化高效液相色譜法分析發(fā)菜胞外多糖的單糖組成

王貴春，陳雪峰*，劉寧，王寧

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021）

采用水溶醇沉法提取發(fā)菜多糖，通過三氟乙酸（TFA）將其水解成單糖，經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化后，利用RP-HPLC分析其單糖組成。結果表明，發(fā)菜胞外多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖組成，其摩爾比為0.71∶0.37∶0.44∶1.53∶1.03∶0.40。該方法具有操作簡便、快捷，重現(xiàn)性良好等特點，可用于發(fā)菜胞外多糖中單糖組成的定性和定量分析。

發(fā)菜胞外多糖，單糖組成，柱前衍生化，高效液相色譜法

發(fā)菜（Nostoc Flagelliforme）是發(fā)狀念珠藍細菌的簡稱，主要生長在中國、蒙古、墨西哥等國［1］，營養(yǎng)價值豐富。發(fā)菜在液體培養(yǎng)過程中向胞外分泌大量的多糖類物質(zhì)［2］，相關研究表明多糖是一類具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血及免疫促進等生物活性的生物大分子［3-5］，而且多糖類化合物在生命活動中具有的生物活性作用與其分子結構存在密不可分的關系，單糖組成分析是多糖結構鑒定的基礎。生物多糖的單糖組成分析常用的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等［6］，薄層色譜法樣品處理繁瑣、鑒別能力不強，已逐漸被儀器分析方法所代替；氣相色譜法對中性糖的分離效果較好，對于糖醛酸含量較高的酸性多糖分離效果差，且前期處理較為復雜［7］，而高效液相色譜法可以很好地將中性糖及糖醛酸進行分離鑒定。本文首次運用柱前衍生化高效液相色譜法對發(fā)菜胞外多糖的單糖組成進行分析。實驗以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）為衍生化試劑，在堿性條件下與多糖水解產(chǎn)物定量縮合生成單糖-PMP衍生物，采用HPLC法分析發(fā)菜胞外多糖的單糖組成，并測定了各單糖的組成比例。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）比利時Acros公司；三氟乙酸（TFA）上海科豐化學試劑有限公司；鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara） 天津西瑪科技有限公司；葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、葡萄糖醛酸（GlcU） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀天津科密歐化學試劑有限公司。

PHSJ-4A型酸度計上海雷磁儀器廠；Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）色譜柱、Waters1525-2487型高效液相色譜系統(tǒng)美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)菜胞外多糖的提取參考陳雪峰等［8］的研究方法，發(fā)菜胞外多糖為水溶性多糖，采用乙醇沉淀的方法提取，分離培養(yǎng)液與發(fā)菜細胞，將培養(yǎng)液濃縮到一定程度，Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)、透析除去小分子鹽，加入乙醇4℃下靜置24h，離心取沉淀，冷凍干燥得發(fā)菜胞外粗多糖。

1.2.2混合單糖標準溶液的制備稱取葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、葡萄糖醛酸（GlcU）標準品，用超純水分別配制成2mmol/L的各單糖標準溶液。取每種單糖標準溶液混勻，配制成混合單糖標準溶液。

1.2.3發(fā)菜多糖的水解［9］稱取發(fā)菜胞外多糖10.0mg，溶于2mL 2mol/L的TFA溶液中，于105℃烘箱中水解2h，冷卻至室溫后，10000r/min離心10min，取上清液，用0.3mol/L NaOH中和至pH7.0，得發(fā)菜胞外多糖水解產(chǎn)物。

1.2.4PMP衍生化標記［10］分別取混合單糖標準溶液和發(fā)菜胞外多糖水解液100μL，至于1.5mL離心管中，依次加入200μL 0.3mol/L NaOH溶液和200μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，渦旋混勻，于70℃水浴反應90min。冷卻至室溫后，加入200μL 0.3mol/L HCl中和，再加入等體積氯仿萃取，振蕩、靜置，棄去有機相，重復操作3次。上層水相經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.2.5色譜條件色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6mm× 250mm，5.0μm）；流動相：乙腈（A）-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9，由磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀配制）（B）；洗脫模式：梯度洗脫，時間梯度為0min→10min→20min→35min→40min，對應流動相體積分數(shù)梯度20%→20%→23%→25%→20%（A）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：245nm；進樣體積：20μL。

1.2.6流動相中乙腈比例的選擇采用0.05mol/L pH6.9的磷酸鹽緩沖液和乙腈作為流動相，進樣混合單糖標準溶液，研究等度洗脫（乙腈比例分別20%、23%、25%）及梯度洗脫對分離效果的影響。

1.2.7方法學考察

1.2.7.1線性關系的考察取2mmol/L混合單糖標準溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分別置于10mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為系列對照品混合溶液。按1.2.4進行衍生化處理，按1.2.5色譜條件進樣分析，計算標準曲線、線性相關系數(shù)及線性范圍。

1.2.7.2穩(wěn)定性實驗取衍生化后混合單糖標準溶液，按1.2.5色譜條件分別在0、3、6、9、12h進樣測定，記錄峰面積，計算各單糖12h內(nèi)的相對標準偏差（RSD）。

1.2.7.3精密度實驗取衍生化后混合單糖標準溶液，按1.2.5色譜條件進行測定，重復進樣5次，記錄峰面積，計算各單糖的RSD。

1.2.7.4重復性實驗稱取5份發(fā)菜多糖，每份10.0mg，按1.2.3方法進行多糖水解，再按1.2.4方法進行衍生化處理，按1.2.5色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算樣品中單糖的RSD。

1.2.8發(fā)菜多糖樣品分析取衍生化后多糖水解物，按1.2.5色譜條件進行測定，將樣品色譜峰保留時間與混合單糖標準溶液色譜峰比對，計算樣品單糖組成摩爾比。

2　結果與分析

2.1流動相的選擇

在選定流動相類型、流速的情況下，考察不同流動相比例對7種單糖衍生物分離效果的差異，結果如圖1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，等度模式下乙腈比例為20%時，Rha與GlcU分離效果差，未完全分離出現(xiàn)重合現(xiàn)象；等度模式下乙腈比例為23%和25%時，Xyl與Ara分離效果差，未完全分離出現(xiàn)重合；而在梯度模式下乙腈比例為20%→20%→23%→25%→20%，時間梯度為0min→10min→20min→35min→40min時，7種單糖峰型和分離效果均達最佳。

2.2方法學考察

2.2.1線性關系的考察通過實驗結果計算得出各單糖標準曲線、線性相關系數(shù)及線性范圍（表1）。由表1可知，各單糖在各自線性范圍內(nèi)有良好的線性關系，線性相關系數(shù)均在0.9912以上。

表1　7種單糖標準曲線和線性范圍Table 1　The standard curves and linear range of seven standard monosaccharides

2.2.2穩(wěn)定性實驗計算混合單糖標準溶液在12h內(nèi)各單糖衍生物峰面積的RSD，依次為Man 1.68%、Rha 0.88%、GlcU 1.08%、Glc 0.76%、Gal 0.89%、Xyl 0.63%、Ara 0.69%，表明在室溫下樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3精密度實驗計算各單糖衍生物峰面積的RSD，依次為Man 0.42%、Rha 0.40%、GlcU 0.58%、Glc 0.85%、Gal 0.66%、Xyl 0.60%、Ara0.55%，表明該儀器方法的精密性良好。

2.2.4重復性實驗計算樣品中各單糖衍生物峰面積的RSD，依次為Man 1.78%、Rha 1.56%、GlcU 1.62%、Glc 0.92%、Gal 1.35%、Xyl 1.26%，表明該方法的重復性良好。

2.3發(fā)菜多糖樣品分析

通過對樣品中色譜峰保留時間與混合標準單糖色譜峰保留時間的對比，如圖2所示，可以確定發(fā)菜多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖組成；由表1標準曲線計算可知，各種單糖對應摩爾比為0.71∶0.37∶0.44∶1.53∶1.03∶0.40。

圖1　不同乙腈比例對單糖衍生物分離效果影響Fig.1　Effect of acetonitrile proportion on the separation of monosaccharide derivatives

3　結論

通過柱前衍生化高效液相色譜法，建立了利用高效液相色譜-紫外檢測器和反相C18柱分離分析發(fā)菜多糖的單糖組成的色譜條件。該方法操作簡便、快捷，重現(xiàn)性好，可以使7種自然界常見單糖得到很好的分離，并可定性、定量分析發(fā)菜多糖的單糖組成及摩爾比。本實驗結果對發(fā)菜多糖組成和結構研究具有一定的指導意義。

圖2　混合標準單糖（A）和發(fā)菜多糖水解物（B）HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of mixed standard monosaccharides and hydrolyzate polysaccharide

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Analysis of monosaccharide compositions of Nostoc Flagelliforme extracellular polysaccharide by pre-column derivation HPLC

WANG Gui-chun，CHEN Xue-feng*，LIU Ning，WANG Ning
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

The polysaccharide was precipitated by ethanol，and hydrolyzed into monosaccharides by trifluoroacetic（TFA）.The hydrolyzate was derivated with 1-phenyl-methyl-5-pyrazolone（PMP）and then the PMP derivates of monosaccharides were determined by RP-HPLC.The results showed that Nostoc Flagelliforme extracellular polysaccharide was composed of mannose，rhamnose，glucuronic acid，glucose，galactose，xylose，and the molar ratio of the six monosaccharides were 0.71∶0.37∶0.44∶1.53∶1.03∶0.40.The established HPLC method was simple，fast and good reproducibility，and could be used for the determination of monosaccharide compositions of Nostoc Flagelliforme extracellular polysaccharide.

Nostoc Flagelliforme extracellular polysaccharide；monosaccharide compositions；pre-column derivation；HPLC

TS207.3

A

1002-0306（2015）10-0059-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.003

2014－08－18

王貴春（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微生物多糖功能與應用。

陳雪峰（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品功能成分及生物技術。

國家青年科學基金項目（31401633）；陜西科技大學后補助項目（2014XHBZ-10）。