氣質(zhì)聯(lián)用法檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚含量并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜驗證

魏斌 陸井蓮 魏云計 張科 朱臻怡 柏愛旭 馮民 王小晉

（淮安出入境檢驗檢疫局 江蘇淮安 223001）

氣質(zhì)聯(lián)用法檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚含量并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜驗證

魏斌 陸井蓮 魏云計 張科 朱臻怡 柏愛旭 馮民 王小晉

（淮安出入境檢驗檢疫局 江蘇淮安 223001）

改進了水產(chǎn)品中己烯雌酚的檢測方法。樣品用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱凈化，BSTFA-TMCS吡啶溶液80°C衍生；經(jīng)過HP-5MS（30m×0.25mm，0.25 μm）毛細色譜柱分離，再經(jīng)過單四級桿質(zhì)譜儀選擇離子掃描（m/z：383、397、412、413）確定兩種結(jié)構(gòu)的衍生物，用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測其衍生物從而間接檢測己烯雌酚。以反式衍生物做定量物質(zhì)，在5-180 μg/kg濃度范圍獲得良好線性（R=0.995）；3個添加濃度（1、2、5 μg/kg）下的平均回收率為90.15%-92.82%，標準偏差為6.7%-9.3%。陽性樣品經(jīng)過乙酸乙酯提取后吹干，HLB固相萃取柱凈化，甲醇定容后，用配備RBAX SB-C18柱（2.1×150mm，3.5 μm）的高分辨率液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行驗證，確保檢測的可靠性。

己烯雌酚；水產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；衍生化

1 前言

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）為人工合成的雌性激素，純的DES為無色晶體或白色晶體粉末，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、油類以及強堿性溶液，難溶于水，曾用于臨床上一些婦科疾病的治療和養(yǎng)殖業(yè)用于促進動物生長，但是其對人體和動物的危害也日益凸顯。上世紀60年代，世界各國已經(jīng)開始在動物飼料中禁止添加，在水產(chǎn)品中規(guī)定不得檢出［1］。2002年，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，DES及其鹽、酯制劑停止在食用動物中使用，第235號公告規(guī)定在動物性食品中不得檢出，第1163號公告規(guī)定在水產(chǎn)品中不得檢出［2］。

目前對于水產(chǎn)品DES的檢測有ELISA法、HPLC法、GC-MS法和LC-MS/MS法［3］。HPLC法的檢測限高達250 μg/kg［4］，顯然不符合相關(guān)公告中不得檢出的要求；而ELISA法雖然檢測限比較低，但只能作為一種篩選方法；另外LC-MS/MS法也可以作為DES的檢測方法且無需衍生，但一方面與之相對應的國家標準GB/T 22963-2008只將測量范圍局限于河豚魚和鰻魚，所以此法也不能廣泛用于水產(chǎn)品中DES的檢測，另一方面LC-MS/MS儀器昂貴，檢測成本較高，不適合大規(guī)模的篩查檢測。農(nóng)業(yè)部1163號公告-9-2009所規(guī)定的氣質(zhì)聯(lián)用法一直是廣大水產(chǎn)品檢測實驗室檢測、出證的主要依據(jù)，本項目參考此方法并用液相串聯(lián)質(zhì)譜對陽性樣品加以驗證，使水產(chǎn)品中DES的檢測更為方便、經(jīng)濟并且有依據(jù)［5-8］。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗樣品

銀魚樣品：超市購買。

2.1.2試劑

甲醇、正己烷、吡啶：色譜級，德國Merck公司；乙酸乙酯：分析純，南京化學試劑有限公司；無水碳酸鈉：分析純，上海國藥集團；衍生化試劑（BSTFA：TMCS=99：1）：美國REGI公司；DES標準品：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

2.1.3主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Trace-DSQII，配有EI離子源，美國Thermo Fisher公司；電子天平：PB-203E型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫氮吹裝置：N-EVAP14165型，美國Organomation聯(lián)合公司；Thermo Finngan TSQ QuantumUltra ENR串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司；進樣瓶兼反應瓶：2 mL，33號透明硼硅酸鹽玻璃帶藍色改性硅樹脂密封圈，美國Thermo Fisher公司。

2.2方法

2.2.1氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5MS彈性石英鍵合毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始柱溫130°C保持1 min，以20°C/min升到180°C保持10 min，再以3°C/min升到230°C保持4min，再以30°C/min升到280°C保持2 min；進樣口溫度：250°C；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；不分流進樣：1 μL；樣品抽吸次數(shù)（plunger strokes）：設為10；進樣口內(nèi)含硅烷化玻璃棉不分流進樣襯托管。質(zhì)譜部分離子源溫度：230°C；接口溫度：280°C；選擇離子模式；DES正反式衍生物監(jiān)控離子均為：383、397、412、413。

2.2.2樣品處理

（1）粉碎

銀魚魚肉樣品經(jīng)粉碎機粉碎均勻。

（2）提取

稱取5 g試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10%碳酸鈉溶液3 mL，加入乙酸乙酯15 mL，渦旋1 min后6000 r/min離心10 min。取上層乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL乙酸乙酯重復提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液。40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL正己烷溶液溶解殘留物，待凈化。

（3）凈化

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化HLB固相萃取柱，取待凈化液過柱，控制流速不超過2 mL/min，用1 mL正己烷再洗滌梨形瓶，洗滌液過柱。抽干小柱，乙酸乙酯10 mL分3次洗脫小柱，控制洗脫速度小于1滴/s。收集洗脫液于10 mL氮吹管中在50℃下吹干，用1 mL無水乙醚溶解殘留物，再用1 mL無水乙醚洗滌氮吹管，合并2次溶液到2 mL反應瓶中并吹干。

（4）衍生化

將上述吹干后的反應瓶中加入100 μL吡啶、50 μL衍生化試劑后擰緊密封蓋，渦旋混勻，加入到80℃烘箱中衍生反應30 min。等冷卻后40℃水浴下氮吹干，用0.5 mL正己烷定容，漩渦混合后GC-MS上機檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1提取與凈化方法

選擇二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙腈幾種常見有機溶劑對銀魚樣品進行提取，結(jié)果顯示經(jīng)二氯甲烷提取的回收率較低（＜80%）；氯仿和乙醚提取的回收率均在80%以上，但蛋白質(zhì)及脂類較多，不利于后一步凈化；乙酸乙酯提取的回收率在80%以上且穩(wěn)定，所溶脂類較少，有利于凈化，因此選用乙酸乙酯作為提取液。在提取時加入10%的碳酸鈉溶液后，回收率可達90%且能有效降低干擾。

根據(jù)DES的結(jié)構(gòu)特點選擇SLH、HLB、C18和石墨碳黑氨基柱進行凈化對比試驗，結(jié)果顯示使用C18柱和石墨碳黑氨基柱的回收率低于50%且淋洗溶劑劑用量較大；SLH柱和HLB柱回收率均可以達到90%以上，但SLH柱在穩(wěn)定性上不如HLB柱，因此選擇HLB柱。分別用正己烷、正己烷：乙酸乙酯（85：15）和乙酸乙酯對HLB柱進行洗脫實驗，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯洗脫效果最好，在10mL洗脫液可達到回收率最大化。

3.2定性方法

DES沸點為407℃，已經(jīng)超過色譜柱的極限溫度（315℃），并且酚羥基有極大的極性，會吸附在色譜柱上造成儀器污染，故需要衍生化反應生成沸點低的硅烷化衍生物，其衍生物EI離子源全掃質(zhì)譜見圖1。

圖1　DES衍生物總離子MS譜圖（經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫搜索確定結(jié)構(gòu)）

m/z 73和m/z 207為硅化合物的碎片，殘留衍生劑也會有此類碎片，故排除此2項。選擇DES部分碎片的離子進行監(jiān)控，分別為m/z 383（25%）、m/z 397（25%）、m/z 412（45%）、m/z 413（100%）。其中，m/z 413和m/z 412為衍生物的母離子，m/z 397為失去一個甲基的離子碎片，m/z 383為失去二個甲基的離子碎片。標準液在SIM模式下的色譜圖見圖2。

圖2　10μg/kg濃度的標準液SIM模式下色譜圖

3.3定量方法

DES具有順反異構(gòu)體，藥用DES為反式，但是在標準品中會有極少量順式結(jié)構(gòu)，提取過程和衍生化中也會有順式異構(gòu)體產(chǎn)生，將順式和反式異構(gòu)體加起來方可定量準確。建立5、10、50、80、180 μg/kg標準溶液組上機操作，結(jié)果顯示順式衍生物線性較差，反式衍生物線性可滿足一般定量要求（R= 0.995）；如果將兩者峰面積相加，則能得到較為良好的線性關(guān)系（R＞0.999），見圖3。但是實際操作中，大多數(shù)儀器公司所配分析軟件版本均無法實現(xiàn)把距離較遠的兩個峰面積進行相加并線性擬合，如每次都導出數(shù)據(jù)再導入專業(yè)計算軟件進行擬合計算則較為費時費力，在實際大批量檢測操作中很難實現(xiàn)。因此用反式衍生物定量即可滿足檢測需要，因DES規(guī)定不得檢出，只檢測順式衍生物也能滿足監(jiān)控需要［9］。

圖3　DES順反式衍生物面積之和與濃度的線性關(guān)系

3.4回收率、精密度和定量限

根據(jù)相關(guān)法律法規(guī)，DES為不得檢出，定量限為0.5 μg/kg，圖4即為添加定量限濃度的色譜圖。對于單四級桿的儀器聯(lián)用儀，可以根據(jù)離子碎片的相對豐度排除基質(zhì)的干擾，因此此方法滿足要求。對銀魚樣品分別添加濃度為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg的標準品進行添加回收實驗，結(jié)果見表1。

圖4　純凈銀魚樣品（上）和添加0.5 μg/kg標準品的銀魚樣品（下）色譜圖對比

表1　銀魚中DES測定的回收率和精密度

3.5衍生化方法的改進

對于DES這類帶羥基基團強極性、高沸點的化合物進行氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測的時候，均需要衍生為低極性、易氣化的化合物。硅烷化衍生是普遍采用的衍生化方式，BSTFA、TMCS組合衍生化試劑也是最常用的衍生化試劑，也可以用N-甲基-N=三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）［11］。另外也可采用酰基化衍生法，比如采用五氟丙酸酐衍生劑［10］。為了和通行標準一致，本項目只研究BSTFA、TMCS組合衍生化試劑，其反應原理如圖5所示。農(nóng)業(yè)部公告中衍生化試劑用100 μL，而從經(jīng)濟性和量取準確性角度考慮，加入50 μL衍生劑比較合適。

圖5　本項目中DES的衍生原理

分別取標DES準樣品2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg加入50 μL衍生化試劑，加入100 μL吡啶溶液，充分震蕩并在80°C衍生30 min，衍生后吹干定容2 mL上機檢測，得到良好線性，見圖6，說明50 μL衍生劑足夠線性濃度范圍內(nèi)的檢測要求。但是在氮氣吹干后僅僅用50 μL衍生劑會導致與瓶壁殘留混合不均勻、衍生效率不高、線性不好等問題，圖7為未加吡啶溶劑的衍生效果，線性相關(guān)系數(shù)只有0.990。如果用100 μL吡啶做溶劑，則可以避免此弊端從而獲得良好線性。但衍生完全后，需要將吡啶吹干后再定容上機，以避免吡啶和衍生劑對毛細管色譜柱造成的損傷。

圖6　50μL衍生劑與2-50 μg DES反應所得線性

3.6液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的驗證

衍生在外標法檢測不得檢出的樣品時存在一些不確定因素和檢測及監(jiān)管上的風險。除了做平行和添加回收以外，很多有條件的實驗室也采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對陽性樣品進行驗證以及排除假陽性。

3.6.1儀器工作條件

色譜條件：RBAX SB-C18柱（2.1×150 mm，3.5 μm）；流動相：A為甲醇，B為H2O；洗脫程序：0-3 min時A由70%線性降至10%并保持4.4 min，7.5 min-10 min時A線性升至70%并保持2.5 min；流量：0.25 mL/min；進樣量：25 μL；柱溫：35℃。質(zhì)譜條件：電噴霧負離子源，負離子掃描方式；離子源溫度：110℃；洗脫氮氣流量：700 L/h；洗脫劑氣溫度：350℃；電離電壓：2.8 kV；母離子：267eV；子離子和碰撞氣能量分別為：222m/z（36eV），237m/z（29eV），251 m/z（27ev）。

3.6.2樣品處理

將5.0 g樣品均勻粉碎后加入50 mL離心管中，加入100 g/L的碳酸鈉溶液3 mL、乙酸乙酯15 mL，渦旋30 s，超聲提取15 min，離心后取上清液于梨子形瓶中；同樣方法提取殘渣1次；合并乙酸乙酯提取液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL甲醇溶解殘留物，凈化方法與氣質(zhì)方法相同。洗脫液吹干后用1 mL 20%的甲醇水溶液溶解殘留物，過0.22 μm濾膜后無需衍生直接上機檢測。

3.6.3驗證討論

建立2-1000 μg/kg濃度范圍內(nèi)共7個點的標準序列，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998，說明在不衍生的條件下液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對DES在較大的濃度范圍具有良好的線性響應。銀魚空白樣和加標0.2 μg/kg的樣品對比如圖8，說明此方法具有較好的靈敏度，適合做為氣質(zhì)方法的補充，來驗證DES。

圖8　空白樣品（上）與添加0.2 μg/kg樣品（下）的液相串聯(lián)質(zhì)譜譜圖

4 結(jié)論

本項目建立的DES氣相色譜質(zhì)譜檢測法，靈敏、可靠、檢測范圍廣、相對成本低。同時用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對陽性樣品進行驗證，使實驗結(jié)果更加可靠，排除假陽性。衍生法配合內(nèi)標法使用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測更加具有可靠性和說服性，尋找一個廉價可靠的內(nèi)標物是今后工作的一個重點。

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Determination of Diethylstilbestol Residue in Aquatic Products by GC-MS and Verification by LC-MS/MS

Wei Bin，Lu Jinglian，Wei Yunji，Zhang Ke，Zhu Zhenyi，Bai Aixu，F(xiàn)eng Min，Wang Xiaojin
（Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian，Jiangsu，223001）

A economical analytical method by chromatograph-mass spectrometer was developed for the diethylstilbestrol（DES）in aquatic products.The samples were extracted with acetic ether，purified by HLB extraction column，and get derivative reaction with BSTFA-TMCS in pyridines at 80°C.The extract was separated on an agilent HP-5MS capillary column（30m×0.25mm，0.25 μm）and detected with high resolution mass spectrometry in SIM mode（m/z：383，397，412，413）.There ware two derivative compounds，Cis-DES-（OTMS）2 and Trans-DES-（OTMS）2 displayed by chromatogram and the Trans-DES-（OTMS）2 was the quantitative compound for DES.The results showed that high correlation coefficients（R=0.995）were obtained within their respective linear ranges when have a range of 5-180 μg/kg.The average recoveries for 1 μg/kg，2 μg/kg，5 μg/kg spiked levels ranged from 90.15%to 92.82%with RSDs of 6.7% -9.3%.The positive samples were verified by LC-MS/MS with RBAX SB-C18 column for higher reliability.

Diethylstilbestrol；Aquatic Products；GC-MS；LC-MS/MS；Derivative Action

C931.2

E-mail：seuwei@126.com

2014-09-18