多種香型白酒中氨基甲酸乙酯殘留含量的研究

黃 松，黃小清，張 輝，劉 佳，王 宇，譚錦萍，彭 程

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）又叫尿烷，是食品發(fā)酵過程中自然產(chǎn)生的物質(zhì)，廣泛存在于酸奶、醬油、酒類等眾多發(fā)酵食品之中[1-2]。1943年科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在動物實(shí)驗(yàn)中能引起受試動物多部位癌變[3]，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2007 年將其歸入2A 可能人類致癌物清單中[4]。EC 主要由乙醇和氨甲?；衔锇l(fā)生反應(yīng)生成，常見的氨甲?；衔镉心蛩?、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸及焦炭酸二乙酯[5]。白酒中EC的產(chǎn)生途徑主要有兩種：一是尿素與乙醇反應(yīng)產(chǎn)生EC，尿素主要來自于環(huán)境或在發(fā)酵過程中由微生物產(chǎn)生[6-7]；二是氰化物被氧化成氰酸鹽與乙醇反應(yīng)生成EC，氰化物由原料中的氰糖苷經(jīng)酶解反應(yīng)或高溫裂解而形成[8-11]。同時，在酒類生產(chǎn)的不同階段EC 產(chǎn)生的主要原因不同。在發(fā)酵階段，EC主要由尿素和乙醇反應(yīng)生成[12]；在蒸餾階段，高溫和酸性條件下，尿素和氰化物均與乙醇反應(yīng)形成EC[11，13]；在儲存熟化階段，在溫度和金屬離子的催化下，EC主要由氰化物生成[14-15，9]。

早在1985 年，加拿大就規(guī)定了威士忌中EC 的限量標(biāo)準(zhǔn)是150 μg/L，隨后美國、日本、巴西等國家也出臺了關(guān)于EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國于1993年公布了首個EC檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)SN 0285—1993《出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢驗(yàn)方法》，隨后又發(fā)布了GB 5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》，但是并沒有制定出相應(yīng)的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。白酒是我國傳承悠久的酒類品種，以其獨(dú)特的風(fēng)味和口感深受民眾喜愛，控制白酒中氨基甲酸乙酯的殘留含量對消費(fèi)者的健康具有重要的意義。本試驗(yàn)采用液液萃取提取出白酒中的EC，以GC-MS 法進(jìn)行定量，檢測了一批白酒基酒樣品和市售的白酒樣品中EC 的含量，同時對比了不同香型白酒和不同等級白酒的EC殘留含量的情況，首次發(fā)現(xiàn)EC的平均含量隨著白酒等級的降低而減小的規(guī)律，為我國白酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒基酒樣品購于廣州市場，主要包括11 個香型的183 個樣品。成品白酒購于廣州市場，主要包括5個香型的47個不同等級的樣品。

試劑及耗材：氨基甲酸乙酯（99%），阿拉丁公司；氨基甲酸乙酯-D5（99.8%），上海安譜；乙酸乙酯、甲醇（色譜純），美國Fisher Chemical 公司；乙醚（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；無水硫酸鈉（色譜純），阿拉丁公司。

儀器設(shè)備：6890-5975C 氣相色譜質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；DB-WAX氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國Agilent 公司；Allegra X-30R Centrifuge 高速離心機(jī)，美國Beckman 公司；MS3 渦旋振蕩器，德國IKA 公司；ME2002E 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；2600TH 數(shù)控超聲波清洗器，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Organomation NEVAP 112氮吹儀，美國Organomation公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定含量的EC 和EC-D5 于不同容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃下儲存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋得到10 mg/L和1.0 mg/L的中間液。

準(zhǔn)確吸取0.05 m、0.1 m、0.5 mL濃度為1.0 mg/L EC 中間液和0.10 m、0.20 m、0.50 m、1.00 mL 濃度為10 mg/L EC 中間液于不同的容量瓶中，再各加0.2 mL 濃度為10 mg/L 的EC-D5 中間液，用甲醇定容至10 mL，得到5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，其中EC-D5的濃度為200 ng/mL。

1.2.2 提取

參照文獻(xiàn)報(bào)道的前處理方法[16]，準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品于15 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)后再加入0.5 g氯化鈉到離心管中，加蓋超聲20 min，向離心管中加入2 mL 5%乙酸乙酯乙醚溶液（5∶95，v∶v）進(jìn)行萃取，渦旋3 min，6000 r/min 離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至裝有5 g無水硫酸鈉的15 mL離心管中。反復(fù)萃取3次，合并上清液，渦旋3 min，6000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，常溫下氮?dú)獯抵两桑? mL 甲醇定容，渦旋，過0.22 μm 有機(jī)濾膜裝瓶備用。

1.2.3 儀器條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱：DB-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度220 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣（99.999 %），恒定流量1.0 mL/min；程序升溫：初溫50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升溫至120 ℃，然后以1 ℃/min升至130 ℃。

質(zhì)譜條件：電離模式，EI（electron impact）；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃，四級桿溫度250 ℃；檢測方式，選擇離子監(jiān)測（SIM）；EC 的選擇監(jiān)測離子（m/z）44、62、74、89，定量離子62；EC-D5選擇監(jiān)測離子（m/z）64、76，定量離子64。

2 結(jié)果與分析

2.1 EC的檢測方法

2.1.1 方法線性、檢出限、定量限

對1.2.1 部分所述的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)為Y=1.003X+0.01856，R2=0.99994，表明在5～1000 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好。通過樣品基質(zhì)加標(biāo)來確定檢出限和定量限，將加標(biāo)樣品逐級稀釋至其分別滿足3 倍和10 倍信噪比，得到檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.6 μg/kg。

2.1.2 加標(biāo)回收率、精密度

選取一個市售白酒樣品作為基質(zhì)，在此基礎(chǔ)上做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)5 μg/kg、25 μg/kg、100 μg/kg 3 個水平，每個水平重復(fù)6 次，加標(biāo)回收結(jié)果和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表1。結(jié)果表明，基質(zhì)樣品的EC平均含量為22.48 μg/kg，3 個不同水平的加標(biāo)平均回收率為91.3 %～105.4 %，RSD 為0.33 %～1.90 %，說明該方法精確性和準(zhǔn)確性良好，滿足實(shí)驗(yàn)需要。

表1 EC的加標(biāo)回收結(jié)果及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.2 白酒基酒樣品中EC檢測結(jié)果與分析

2.2.1 白酒基酒樣品的檢測結(jié)果

取183個白酒基酒樣品進(jìn)行EC含量的測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如表2 所示，所測試的基酒樣品中，EC的檢出率為100%，其范圍為3.01～544.74 μg/kg，平均值為178.90 μg/kg，該結(jié)果與此前文獻(xiàn)報(bào)道的信息保持一致[14]。

表2 白酒基酒樣品的EC值

2.2.2 不同香型白酒樣品EC平均值的比較

統(tǒng)計(jì)11 種香型的白酒基酒樣品的EC 平均值，可以得到圖1。由圖1 可知，米香型白酒基酒樣品的EC平均含量最低，為39.30 μg/kg，其次是豉香型（61.98 μg/kg）和清香型（88.06 μg/kg）；濃香型的EC 平均含量最高，為322.09 μg/kg，其次是鳳香型（267.86 μg/kg）和芝麻香型（199.77 μg/kg）。米香型、豉香型白酒主要以大米為原料，具有醪液發(fā)酵的酸度不大、發(fā)酵溫度低、發(fā)酵時間短等特點(diǎn)，這些條件較為溫和，故而EC的生成量較少[17-18]。清香型白酒基酒樣品的EC 值范圍為3.01～213.31 μg/kg，該類型白酒中EC 的含量波動范圍較大，是因?yàn)槠浒l(fā)酵條件溫和，產(chǎn)生的EC并不多，但是在儲存過程中受光照、溫度、金屬離子等條件的影響，可以形成大量的EC，導(dǎo)致最后含量升高[19-20]。濃香型白酒多采用多菌種發(fā)酵，使用小麥、豌豆等高蛋白質(zhì)含量的原料，加之入庫儲存時間長而形成大量EC[21-22]。鳳香型和芝麻香型白酒的發(fā)酵工藝多具有高酸度、高氮配比、中高溫復(fù)合用曲、長時間連續(xù)發(fā)酵等特點(diǎn)，使得酒樣中EC含量升高[23-25]。

圖1 不同香型白酒基酒樣品的EC平均值

2.2.3 不同等級白酒樣品的EC平均值的比較

白酒基酒樣品經(jīng)過專業(yè)感官評定人員按照感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)打分后分成優(yōu)級、一級和二級三個級別，比較各個香型白酒3 個等級的EC 平均值（見圖2）可知，大部分白酒的EC 值隨著等級的降低而減小。這可能是因?yàn)镋C 的含量與白酒樣品中總酸總酯的含量變化趨勢保持一致，特級白酒的總酸總酯含量高，同時EC 的含量也相對較高。但是，特香型白酒樣品不符合這一趨勢，原因有待進(jìn)一步研究。

圖2 各個香型不同等級白酒的EC平均含量

2.3 市售白酒樣品的EC檢測結(jié)果與分析

分析市售的5 種香型47 個白酒樣品的EC 含量，得到結(jié)果如表3 所示。所有樣品中EC 的檢出率為100 %，其范圍為2.82～192.67 μg/kg，平均值為52.79 μg/kg。其中含量最高的是醬香型白酒，其次是濃香型、豉香型、清香型，米香型最低。市售成品白酒的EC 平均含量遠(yuǎn)小于白酒基酒樣品中EC平均含量，這表明白酒從基酒經(jīng)過勾兌之后變成成品酒，其EC的含量有較大幅度的減小。

表3 不同香型的市售白酒樣品EC值

購買的成品白酒包括豉香型、醬香型、米香型、濃香型和清香型等5 種香型的3 個等級酒樣，分析其中EC 含量可得圖3。由圖3 可知，白酒中EC 的含量隨著其等級的降低而減小，該趨勢與白酒基酒樣品中的EC含量變化趨勢吻合。

圖3 市售白酒樣品不同等級的EC平均值

3 結(jié)論

采用液液萃取提取結(jié)合GC-MS 定量檢測，分析了183 個白酒基酒樣品和47 個市售白酒成品樣品中EC的殘留含量。結(jié)果表明，兩種酒樣中EC的檢出率均為100%，說明白酒樣品中EC 的殘留是普遍存在的。不同類型的白酒基酒樣品中的EC 值差異較大，表明白酒的生產(chǎn)工藝和儲存條件對酒樣中EC 的殘留含量有很大的影響。白酒基酒樣品中，EC 含量最高的3 種是濃香型、鳳香型和芝麻香型白酒，含量最低的3 種是米香型、豉香型和清香型。市售成品白酒樣品中醬香型EC含量最高，米香型最低。成品白酒的EC 平均含量為52.79 μg/kg，遠(yuǎn)低于白酒基酒樣品的178.90 μg/kg，說明經(jīng)過勾兌后成品白酒樣品中EC 的平均含量有較大幅度的降低。但是考慮到白酒在我國的受歡迎程度和EC 的潛在危害性，白酒樣品中EC 高殘留的問題仍亟待解決。