兒康合劑定性定量方法的研究

陽建軍劉淑梅李洪貴陽之韻

（1 郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000；2 中山大學藥學院，廣東 廣州 510006）

兒康合劑定性定量方法的研究

陽建軍1劉淑梅1李洪貴1陽之韻2

（1 郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000；2 中山大學藥學院，廣東 廣州 510006）

目的 建立兒康合劑的質(zhì)量控制方法。方法 采用薄層色譜對方中君藥黃芪和白術進行鑒別；采用高效液相色譜法對黃芪中的主要成分黃芪甲苷進行含量測定。高效液相色譜柱為Welch XtimateTM C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：流動相為乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；漂移管溫度70 ℃；噴霧器溫度36 ℃；增益10；氣體壓力40.0 psi。結果 黃芪和白術薄層色譜斑點分離清晰，專屬性強。黃芪甲苷在0.3068～1.534 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關系，r=0.9992，平均加樣回收率為98.26%，RSD=0.47%（n=9）。結論 建立的定性定量方法簡便準確，重復性好，可用于兒康合劑的質(zhì)量控制。

兒康合劑；薄層色譜；高效液相色譜法；蒸發(fā)光散射檢測器

兒康合劑是郴州市第一人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要由黃芪、白術、茯苓、木瓜、豆蔻、牡蠣、雞內(nèi)金等藥物組成，有益氣健脾，固表止汗的功效，在醫(yī)院臨床使用多年，主要用于小兒厭食，多汗，體虛易感等。目前兒康合劑質(zhì)量標準比較簡單，只有單一鑒別實驗，沒有量化標準，難以對其質(zhì)量達到全面控制，為了有效控制藥品的質(zhì)量，筆者采用薄層色譜對兒康合劑中的君藥黃芪和白術進行定性鑒別，用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，提高和規(guī)范兒康合劑質(zhì)量標準，為制劑生產(chǎn)、檢驗、使用提供科學、先進、可控質(zhì)量依據(jù)，保證制劑安全、有效、穩(wěn)定，給醫(yī)院帶來一定經(jīng)濟效益和社會效益。

1　材料與儀器

1.1材料：黃芪對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120974-200609）；黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111730-200604，供含量測定用）；白術對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120925-200407）；兒康合劑（郴州市第一人民醫(yī)院自制，100毫升/瓶。批號：101113、110422、110915）；乙腈和甲醇為色譜純，石油醚、氯仿、正丁醇、氨水、硫酸、正己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醇等其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.2儀器：AUW220D分析天平（日本島津公司）；Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2424；GA-10B低噪音空氣泵（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司）；YO-KO-ZX型紫外分析暗箱（武漢藥科新技術公司）；薄層板：硅膠G10 cm×20 cm，10 cm×10 cm預制板（青島海洋化工廠）；JAC-400型超聲清洗器（濟寧奧波超聲有限公司）。

2　方法與結果

2.1薄層鑒別

2.1.1黃芪鑒別［1］：黃芪供試品溶液制備：取本品25 mL至具塞錐形瓶中，用水飽和正丁醇30 mL超聲15 min，提取2次，合并正丁醇液置于分液漏斗中，用氨試液50 mL振搖洗滌1次，靜置分層，分取上層正丁醇液、水浴蒸干，殘渣加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為供試品溶液。黃芪對照藥材溶液的制備：取黃芪對照藥材2 g，同供試品法制成對照藥材溶液。黃芪陰性樣品液的制備：按兒康合劑的制備工藝制備缺黃芪藥材的陰性制劑，按上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。同時稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL約含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中國藥典》2010年版附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取上述四種液體各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰取出。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點；紫外光燈（365 nm）下顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾，黃芪甲苷的Rf值為0.5（圖1）。

2.1.2白術鑒別［2］：白術供試品液制備：取本品50 mL，用正己烷20 mL超聲提取15 min，分離正己烷液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至1 mL容量瓶中，作為供試品溶液。白術陰性樣品液制備：取按兒康合劑相同制備工藝制成的，不含白術藥材的陰性制劑，用上述供試品液制備方法制成陰性樣品溶液。同時稱取白術對照藥材0.5 g，加正己烷20 mL，按上述供試品液制備方法制成對照藥材溶液。依據(jù)《中國藥典》2010年版附錄ⅥB照薄層色譜法，吸取上述三種液體各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（10∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果在供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點；紫外光燈（365 nm）下顯相同顏色的熒光斑點，而陰性樣品無干擾（圖2）。

圖1　黃芪TLC鑒別圖

圖2　白術TLC鑒別圖

圖3　樣品HPLC色譜圖

2.2含量測定［3-4］

2.2.1對照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對照品16.42 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，作為濃度為1.642 mg/mL對照品儲備溶液。

2.2.2供試品溶液的制備：精密量取本品25 mL，置具塞錐形瓶中，用水飽和正丁醇20 mL超聲提取3次，每次20 min，合并正丁醇液置于分液漏斗中，用氨試液充分洗滌4次，每次15 mL，棄去氨液，再用水洗滌兩次，每次15 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得樣品供試液。

2.2.3陰性樣品溶液的制備：除黃芪藥材外，按照兒康合劑處方用量，取其他藥材，模擬兒康合劑的制備方法，制成不含黃芪藥材的陰性樣品，按照“2.2.2”項下方法進行樣品處理，制備陰性樣品溶液備用。

2.2.4色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗：分別精密取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各20 μL，注入液相色譜儀，結果：供試品溶液與對照品溶液在相同的保留時間處有相同的色譜峰，陰性對照液與對照品溶液及供試品溶液在相同的保留時間處無相應的色譜峰，供試品溶液有效峰與雜質(zhì)峰能分離較好，分離度為2.4，拖尾因子0.52，色譜柱為Welch XtimateTM C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：流動相為乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；漂移管溫度70 ℃；噴霧器溫度36 ℃；增益10；氣體壓力40.0 psi；檢測器波長：203 nm；理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計不得少于2000（圖3）。

2.2.5線性關系的考察：分別精密吸取對照品儲備液溶液0.2、0.3、0.6、1.0、2.0 mL至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，得濃度為0.164、0.246、0.492、0.820、1.640 mg/mL的標準溶液，分別精密吸取上述標準溶液20 μL，按“2.2.4”項下方法測定其峰面積，以黃茂甲苷對照品濃度為橫坐標X，峰面積積分值為縱坐標Y，進行線性回歸，其回歸方程Y=1.6982X+15.344，r=0.9992（n=5）。結果表明黃芪甲苷在0.328～3.280 μg進樣范圍內(nèi)，其濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關系（表1）。

表1　標準品濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)

表2　3批兒康合劑黃芪甲苷含量測定結果及RSD值（n=3）

2.2.6精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液20 μL，重復進樣5次，計算其峰面積RSD=0.63%（n=5），結果表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液20 μL，在0、1、3、5、8 h分別進樣20 μL，計算峰面積RSD為0.56%（n=5）。結果表明供試品溶液峰面積在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8重復性試驗：取同一批號101103兒康合劑樣品5份，每份25 mL，按“2.2.2供試品溶液的制備法”項下方法分別制備供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件測定5份供試品溶液的黃芪甲苷含量，結果黃芪甲苷平均含量0.0875 mg/mL，RSD=1.54%（n=5）。

2.2.9加樣回收試驗：精密吸取批號101103，已知含量為0.0875 mg/mL的兒康合劑樣品9份，每份25 mL，三份為一組，每組分別精密加入濃度為0.492 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液3.50、4.50、5.50 mL，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測定，計算回收率，結果平均加樣回收率為99.73% ，RSD=1.17%（n=9）。說明此方法穩(wěn)定可靠，可用于樣品的含量測定。

2.2.103批樣品含量的測定：取3個批號的兒康合劑（101103、110422、110915）按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按照“2.2.4”項下色譜條件測定，計算3批樣品中黃芪甲苷的含量。見表2。

3　討 論

3.1薄層色譜條件的考察：在參照2010版《中國藥典》一部有關黃芪和白術藥材的色譜條件的基礎上做了一些改進，黃芪定性鑒別的供試液制備中，用正丁醇超聲提取15 min后，各成分的提取效果比直接用正丁醇振搖提取要完全，且干擾成分無明顯影響，又可防止振搖過程中樣品液乳化難以分層的現(xiàn)象，縮短了樣品處理時間。另外，在本實驗中，黃芪甲苷顯色較慢，在顯色過程中，需將用10%硫酸乙醇顯色后的薄層板在105 ℃烘箱中加熱5～8 min，斑點顯色清晰，又不會板被烤焦。薄層板展開時，展距在8～12 cm時各斑點清晰分開，分離效果較佳。

白術制備供試液時考察了提取溶劑乙醚、石油醚和正己烷，結果正己烷的提取液斑點分離清晰，無拖尾現(xiàn)象，干擾成分少，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

通過對三批樣品的檢查，在本實驗條件下，黃芪、白術各組分斑點顯色清晰，分離較好，且陰性對照無干擾，專屬性強，薄層色譜重現(xiàn)性較好，此方法可作為兒康合劑中黃芪和白術的定性鑒別。

3.2黃芪甲苷高效液相色譜條件的考察：對黃芪甲苷的提取分離方法進行了考察，本品超聲提取3次，每次20 min之后，黃芪甲苷的含量已沒有明顯變化，因此無需再延長提取時間和次數(shù)。2010版《中國藥典》黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定時，樣品需要過D101型大孔吸附樹脂柱處理，而本制劑，經(jīng)過正丁醇提取和氨試液、水洗處理之后，其甲醇溶液用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，高效液相色譜圖已無雜質(zhì)干擾，且色譜峰穩(wěn)定，分離度等已均達到《藥典》高效液相色譜法測定相關要求，因此，本品無需用D101型大孔吸附樹脂柱處理。

實驗中流動相的種類和流動相比例對各組分的色譜峰的分離度和出峰時間有一定影響，通過試驗比較，最后確定采用乙腈∶水（32∶68），在此比例下，黃芪甲苷的峰型和分離度均較好，同時陰性樣品無干擾。通過三批樣品的重復測定結果（表2），表明本方法較簡便、穩(wěn)定、準確、重現(xiàn)性好，可以作為我院院內(nèi)制劑兒康合劑黃芪甲苷的含量測定方法。

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2010：283.

［2］李耀榮，徐青青，莫玉芳.益氣通鼻顆粒中白術鑒別方法探討［J］.中國藥業(yè)，2009，18（24）：32-33.

［3］陳榮，黃夢嫻.HPLC法測定歸茂補血口服液中黃苗甲昔的含量［J］.中國藥師，2009，12（1）：77-79.

［4］劉秋鶴，付小六，馬閣.高效液相色譜法測定復明口服液中黃芪甲苷的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2009，3（8）：24-25.

R282.71

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1671-8194（2015）28-0041-03