人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體穩(wěn)定過表達(dá)基因工程修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞亞細(xì)胞系的建立

林榕 左偉敏 祝玲 王瑾 路君 黃梁滸 王慶華 譚建明 王水良

·論著·

人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體穩(wěn)定過表達(dá)基因工程修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞亞細(xì)胞系的建立

林榕 左偉敏 祝玲 王瑾 路君 黃梁滸 王慶華 譚建明 王水良

目的 通過基因工程修飾法建立腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）穩(wěn)定過表達(dá)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞亞系（hUC-MSC_TRAIL）。方法 人TRAIL全長(zhǎng)蛋白編碼序列（CDS）由PCR法擴(kuò)增而得，PCR產(chǎn)物經(jīng)NotⅠ和MluⅠ雙酶切并純化后，亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS。重組載體經(jīng)PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定，再行DNA直接測(cè)序驗(yàn)證后命名為人TRAIL表達(dá)慢病毒載體pLEX-hTRAIL。pLEX-hTRAIL與相應(yīng)包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G經(jīng)聚乙烯亞胺介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞以包裝慢病毒。P4代hUC-MSC經(jīng)慢病毒感染24 h，再行嘌呤霉素篩選2周后，抽提細(xì)胞基因組DNA，行PCR法鑒定hTRAIL cDNA在hUC-MSC基因組中的整合情況；同時(shí)抽提細(xì)胞總RNA，并行RT-PCR法檢測(cè)外源hTRAIL在hUC-MSC中的mRNA表達(dá)水平，以及實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27的表達(dá)，采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定結(jié)果表明，本研究已成功構(gòu)建人TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL，直接DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)克隆得到的人TRAIL蛋白編碼序列準(zhǔn)確無誤；病毒包裝及細(xì)胞感染的鑒定結(jié)果說明，慢病毒感染法可成功介導(dǎo)外源人TRAIL在hUC-MSC的穩(wěn)定整合和高表達(dá)；實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果則顯示，與對(duì)照慢病毒感染后的細(xì)胞相比，hTRAIL表達(dá)慢病毒感染后其細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27的mRNA表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.19倍（P = 0.141）、0.94倍（P = 0.745）、0.95倍（P = 0.047）和1.01倍（P = 0.567），表明外源TRAIL高表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的hUC-MSC生長(zhǎng)增殖等表型無顯著影響。結(jié)論 本研究經(jīng)基因工程修飾法成功構(gòu)建了具外源TRAIL穩(wěn)定高表達(dá)的hUC-MSC亞細(xì)胞系，該亞細(xì)胞系的建立為后續(xù)靶向攻擊TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞治療的探索奠定了基礎(chǔ)。

基因修飾； 臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； TRAIL； 細(xì)胞系，腫瘤

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）因其高度自我更新和增殖能力、以及多向分化潛能而在退行性疾病以及老年相關(guān)性疾病的細(xì)胞治療中得以廣泛應(yīng)用［1］。眾多研究早已表明，MSC也能靶向遷移至腫瘤組織，從而成為腫瘤微環(huán)境中重要的組成成分［2-3］。迄今，盡管MSC在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用尚存爭(zhēng)論，可能因腫瘤的組織類型和發(fā)生發(fā)展階段的不同而各異，但其富集至腫瘤組織這一特性使其成為向腫瘤靶向運(yùn)送特異性抗癌活性分子的合適載體細(xì)胞而備受關(guān)注［4-7］。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）可通過與細(xì)胞表面的跨膜死亡受體DR4和DR5結(jié)合而特異誘導(dǎo)特定腫瘤細(xì)胞的凋亡，TRAIL觸發(fā)的凋亡通路中關(guān)鍵分子也因而成為腫瘤靶向治療中良好的候選靶標(biāo)，基于這些靶標(biāo)的諸多腫瘤靶向治療策略如重組TRAIL或DR激動(dòng)性抗體的導(dǎo)入在體外細(xì)胞水平、臨床前動(dòng)物水平、以及一些臨床試驗(yàn)中都顯示出較好的抗腫瘤效應(yīng)［8-9］。鑒于重組TRAIL在血清中的半衰期短，這在較大程度上限制了其臨床抗腫瘤的療效［10］。為探索人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell， hUC-MSC）是否可作為向腫瘤靶向遞送TRAIL的載體細(xì)胞，本研究中經(jīng)基因工程修飾法成功構(gòu)建了具外源TRAIL穩(wěn)定高表達(dá)的hUC-MSC亞細(xì)胞系，該亞細(xì)胞系的建立為后續(xù)靶向攻擊TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞治療的探索奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞和質(zhì)粒：hUC-MSC來源于福州總醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞組，取P4代細(xì)胞。人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS購(gòu)自美國(guó)Open Biosystem公司，慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。

2.酶和試劑：PCR試劑盒及DNA marker購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成（序列見表1）；PhusionTM高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ和MluⅠ、快速連接試劑盒為New England BioLabs公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、低糖DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Polybrene和聚乙烯亞胺（PEI）購(gòu)自美國(guó)Sigama公司；嘌呤霉素購(gòu)自ACROS公司；MTS和PMS購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Life technolgies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒和基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)TIANGEN公司；SYBR和質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自美國(guó)ROCHE公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的DMEM/F12；hUC-MSC的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于含5% CO2飽和濕度的37℃溫箱中。

2.人TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL的構(gòu)建：常規(guī)抽提hUC-MSC總RNA，并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為總cDNAs，再以其為模板利用PhusionTM高保真DNA聚合酶通過常規(guī)的兩輪PCR法擴(kuò)增得到人TRAIL的完整編碼區(qū)（hTRAIL-CDS），所用引物為：上游5'-ATAGCGGCCGCATGGCTAT GATGGAGGTCCA-3'；下游5'-GCG ACGCGTTT AGCCAACTAAAAAGGCCCCA-3'；上下游引物分別含NotⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)（粗斜體下劃線所示），PCR擴(kuò)增片段為866 bp。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)NotⅠ和MluⅠ雙酶切，重新膠回收純化并與同樣經(jīng)NotⅠ和MluⅠ雙酶切的慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS連接構(gòu)建成人TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL（質(zhì)粒構(gòu)建流程見圖1）。重組載體經(jīng)酶切和PCR法鑒定后再行測(cè)序（上海生工生物工程公司）以證實(shí)，正確的重組質(zhì)粒經(jīng)大量擴(kuò)增后-20℃保存待用。人TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL的構(gòu)建流程見圖1所示。

圖1　人hTRAIL 慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL 的構(gòu)建流程

表1　RT-PCR擴(kuò)增引物序列、擴(kuò)增片段及退火溫度

3.慢病毒的包裝：正常培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞傳入100 mm培養(yǎng)皿后，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，以聚乙烯亞胺（PEI）為介導(dǎo)，將pLEX-hTRAIL（或空載體pLEX-MCS）連同兩個(gè)包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G行共轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染12 h后吸去轉(zhuǎn)染液，換正常培養(yǎng)基并置回溫箱培養(yǎng)，每隔24 h后收集含慢病毒的培養(yǎng)液，經(jīng)過濾（0.45 μm濾器）后分裝，-80℃保存待用。

4.慢病毒的感染：正常培養(yǎng)的P4代hUCMSC接種至100 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)吸去培養(yǎng)基，將適量慢病毒稀釋入含Polybrene（終濃度8 μg/ml）的常規(guī)培養(yǎng)基后加至培養(yǎng)皿中。感染24 h后，棄去感染液，換含嘌呤霉素（終濃度1 μg/ml）的新鮮培養(yǎng)基篩選；此后細(xì)胞正常傳代培養(yǎng)，并維持嘌呤霉素篩選兩周。

5.外源hTRAIL-CDS在hUC-MSC基因組整合的鑒定：常規(guī)法抽提細(xì)胞基因組DNA，行PCR法鑒定外源hTRAIL-CDS在hUC-MSC基因組中的整合情況，所用引物為人TRAIL表達(dá)鑒定的RT-PCR引物（表1），PCR體系同后述常規(guī)PCR擴(kuò)增體系。

6.RT-PCR：依TRIzol法抽提培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA；取各樣本2 μg總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以β-actin為內(nèi)參，行常規(guī)及實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分析TRAIL、Cyclin D1、Cyclin E1、p21和p27基因mRNA在對(duì)照和TRAIL表達(dá)慢病毒感染后hUC-MSC中的表達(dá)情況。各基因RT-PCR擴(kuò)增引物及PCR退火溫度見表1，常規(guī)PCR擴(kuò)增體系含：2.5 μl 10 × buffer、上下游引物各100 pmol、1.5 μl dNTP（2.5 mmol/L each）、Taq酶1.25 U、cDNA 1 μl，ddH2O補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，特定溫度退火30 s，72℃延伸30 s的條件下循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像儀成像。實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系為：10 μl 2 × SYBR混合物、上下游引物各100 pmol、cDNA 1 μl，ddH2O補(bǔ)足至20 μl；PCR循環(huán)條件同上，反應(yīng)于ABI 7900HT Fast PCR儀上完成?；虮磉_(dá)的相對(duì)定量方法為：以β-actin基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)對(duì)照，首先依據(jù)公式ΔCt = Ct靶基因- Ct β-actin，分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ΔCt；再依公式ΔΔCt = ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組計(jì)算出ΔΔCt值；最后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的差值即2-ΔΔCt。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做3個(gè)重復(fù)孔，取各次實(shí)驗(yàn)的±s為最后結(jié)果，并以t檢驗(yàn)行差異顯著性分析。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、人TRAIL蛋白編碼序列全長(zhǎng)的獲得

鑒于hUC-MSC中TRAIL呈低表達(dá)，故本研究采取同樣引物行兩輪PCR擴(kuò)增法以獲得足夠量的hTRAIL-CDS，即第一輪PCR以hUCMSC的總cDNAs為模板，第二輪PCR以第一輪PCR的產(chǎn)物經(jīng)1：100稀釋后作模板再行擴(kuò)增。人TRAIL蛋白編碼序列全長(zhǎng)共846 bp，上、下游擴(kuò)增引物另含酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基20 bp，故PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總大小為866 bp，如圖2所示，二輪PCR產(chǎn)物與預(yù)期相符，且產(chǎn)物量豐富。

圖2　人hTRAIL 蛋白編碼區(qū)CDS 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

二、重組人TRAIL慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL的鑒定

重組慢病毒表達(dá)載體pLEX-hTRAIL初步以酶切和PCR法鑒定。依酶切圖譜分析，正確的重組載體經(jīng)NotⅠ單酶切后線性化，大小為11 528 bp（圖3a泳道1）；而經(jīng)NotⅠ和MluⅠ雙酶切后應(yīng)可見一大小為846 bp的小片段即人TRAIL蛋白編碼序列，另一大片段為骨架質(zhì)粒10 682 bp（圖3a泳道2）。同時(shí)，PCR法也證實(shí)重組載體含人TRAIL完整編碼區(qū)（圖3b）；重組質(zhì)粒還經(jīng)直接測(cè)序，并與GenBank中的參考序列（NCBI序列號(hào)：NM_003810）比對(duì)后，證實(shí)重組載體中的hTRAIL-CDS序列準(zhǔn)確無誤（結(jié)果未顯示）。

三、外源hTRAIL-CDS在hUC-MSC基因組中整合及穩(wěn)定表達(dá)

hUC-MSC經(jīng)對(duì)照或hTRAIL表達(dá)慢病毒感染并篩選兩周后，抽提基因組DNA并行PCR法鑒定，結(jié)果表明：外源hTRAIL-CDS已整合入經(jīng)hTRAIL表達(dá)慢病毒感染的hUC-MSC基因組中（圖4）。同時(shí)，普通以及實(shí)時(shí)定量RT-PCR鑒定結(jié)果也證實(shí)，外源hTRAIL在hUC-MSC中得以成功高表達(dá)（表2，圖5）。

圖3　重組人TRAIL 慢病毒表達(dá)載體pLEXhTRAIL的鑒定

四、外源人TRAIL過表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)hUCMSC生長(zhǎng)增殖調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)無顯著影響

經(jīng)初步觀察，與對(duì)照病毒感染的hUCMSC_CV相比，TRAIL過表達(dá)hUC-MSC_TRAIL其形態(tài)以及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速率并無明顯改變。普通和實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果則顯示，與對(duì)照慢病毒感染相比，TRAIL過表達(dá)hUCMSC_TRAIL細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27 mRNA表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.19倍（P = 0.141）、0.94倍（P = 0.745）、0.95倍（P = 0.047）和1.01倍（P = 0.567）（表2，圖6，7）。依實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，通常認(rèn)為相對(duì)表達(dá)倍數(shù)＞ 2或＜ 0.25為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；據(jù)此，RT-PCR分析結(jié)果表明外源TRAIL高表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的hUC-MSC生長(zhǎng)增殖等表型無顯著影響。

表2　hUC-MSC細(xì)胞TRAIL及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果

圖4　外源hTRAIL-CDS 在hUC-MSC 基因組中整合的鑒定

圖5　外源hTRAIL 在hUC-MSC 中表達(dá)的RT-PCR 鑒定

討　論

細(xì)胞治療作為一種新的治療手段，迄今已在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中得以廣為應(yīng)用［1，11］。在細(xì)胞的選擇中，MSC作為成體干細(xì)胞的一種，因其自我更新和增殖能力強(qiáng)、并具多向分化潛能和體內(nèi)輸注后定向遷移至受損傷或腫瘤部位等特點(diǎn)而成為細(xì)胞治療良好的候選細(xì)胞［12］。依其來源不同，MSC有骨髓MSC、脂肪MSC和UCMSC之分；其中UC-MSC以其低免疫原性和來源豐富而成為眾多臨床細(xì)胞治療的首選［13］。

隨著腫瘤細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的不斷深入，MSC在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益凸顯；但在不同腫瘤以及同一腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，MSC所起的作用卻大相徑庭，其作用機(jī)理也各異。例如，Zhu等［14］曾報(bào)道人MSC可通過分泌DKK-1而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；但同時(shí)，諸多研究也證實(shí)MSC有助于腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物所誘導(dǎo)的凋亡以及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的“助紂為虐”性作用［15-17］。鑒于此，在充分闡明MSC在某一特定腫瘤發(fā)生發(fā)展的特定階段所起作用的確切分子機(jī)理的基礎(chǔ)上，如何通過藥物（或生物活性分子）處理和/或基因工程修飾等手段，以期“趨利避害”，將MSC最終改造成為能靶向攻擊特定腫瘤的載體細(xì)胞，這對(duì)其臨床療效的取得將至關(guān)重要。

圖6　TRAIL 過表達(dá)hUC-MSC 細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)水平RT-PCR 分析結(jié)果

圖7　普通RT-PCR 的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

在通過基因工程修飾定向改造腫瘤靶向MSC的探索中，較早納入研究的有包括NK4［5］和CX3CL1［7］等多種基因；近年來，TRAIL則因其高效介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)而備受關(guān)注［8-10］。2012年，Lee等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，通過TNF-α預(yù)處理的MSC其TRAIL的表達(dá)顯著增高，并可高效誘導(dǎo)MDA-MB-231等TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞的凋亡。鑒于經(jīng)預(yù)處理的MSC其TRAIL的高表達(dá)仍為瞬時(shí)效應(yīng)，細(xì)胞輸注至體內(nèi)后其TRAIL的高表達(dá)及其抗癌活性所維系的時(shí)間也勢(shì)必有限。在本研究中，基于前期工作基礎(chǔ)［19］，為建立TRAIL穩(wěn)定高表達(dá)hUC-MSC亞系，本研究首先經(jīng)分子克隆法成功地構(gòu)建了人TRAI表達(dá)慢病毒載體pLEX-hTRAIL；隨之，通過慢病毒包裝及細(xì)胞感染和鑒定，結(jié)果表明慢病毒感染法可成功介導(dǎo)外源人TRAIL在hUC-MSC的穩(wěn)定整合和高表達(dá)。同時(shí)，初步的表型觀察表明，TRAIL過表達(dá)并不會(huì)造成體外培養(yǎng)的hUC-MSC形態(tài)的明顯改變；細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的分析結(jié)果則顯示，與對(duì)照慢病毒感染后的細(xì)胞相比，hTRAIL表達(dá)慢病毒感染后其Cyclin D1、Cyclin E1、p21WAF1/CIP1和p27的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著差別，表明外源TRAIL高表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的hUC-MSC生長(zhǎng)增殖等表型無明顯的影響。

綜上，盡管其體外和體內(nèi)抗腫瘤的效應(yīng)性仍有待進(jìn)一步的研究證實(shí)，但本研究建立的外源TRAIL穩(wěn)定高表達(dá)的hUC-MSC亞細(xì)胞系無疑為后續(xù)靶向攻擊TRAIL敏感腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞治療的探索奠定了基礎(chǔ)。誠(chéng)然，隨著MSC靶向遷移至腫瘤部位分子機(jī)理的深入闡明［20-21］，如何通過基因工程修飾等方法進(jìn)一步修飾TRAIL高表達(dá)MSC，以期實(shí)現(xiàn)其體內(nèi)輸注后更加高效地富集至腫瘤部位以發(fā)揮其抗癌效應(yīng)將是下一步努力的方向。

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Genetically engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells with stable overexpression of human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

Lin Rong，Zuo Weimin， Zhu Ling， Wang Jin， Lu Jun， Huang Lianghu， Wang Qinghua， Tan Jianming， Wang Shuiliang. Fujian Key Laboratory of Transplant Biology， Fuzhou General Hospital， Xiamen University， Fuzhou 350025， China

Wang Shuiliang， Email： shuiliang.wang@xmu.edu.cn

Objective To establish genetically engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUC-MSC） with overexpression of hTRAIL for cancer therapy. Methods The entire coding sequence （CDS） of human tumor necrosis factor （TNF）-related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） was amplified from cDNAs of hUC-MSC cells. Theamplified fragments were purified and digested with Not I and Mlu I， and then inserted into the lentiviral expression vector LentiORF pLEX-MCS. The recombinant was identified with both PCR and restriction digestion. After verification by DNA sequencing， the recombinant （with accurate sequence of hTRAIL CDS） was nominated as pLEX-hTRAIL. The lentiviral expression vector pLEX-hTRAIL and lentivirus packaging plasmids psPAX2 and pMD2.G were cotransfected into virus packaging cell line HEK293T using PEI to produce lentiviruses. Human umbilical cord mesenchymal stem cells were infected with hTRAIL-expressing lentiviruses and then subjected to selection with puromycin. The integration of exogenous hTRAIL cDNA into the genome of hUC-MSCs was detected with PCR and overexpression of hTRAIL was analyzed with both regular and real-time qRT-PCR. Also， the same method was carried out to analyze the mRNA expression of cell cycle regulators Cyclin D1， Cyclin E1， p21WAF1/CIP1 and p27. Analysis of variance and t test was used for statistical analysis. Results The recombinant pLEX-hTRAIL with insert of human TRAIL cDNA was verified by PCR， restriction digestion，as well as direct DNA sequencing. After infection， the integration of exogenous hTRAIL cDNA in the genome of hUC-MSC was shown by PCR and the successful expression of exogenous hTRAIL in hUC-MSC was confirmed by both regular and real-time quantification RTPCR. In addition， the real-time RT-PCR results indicated that the lentiviral system mediated overexpression of exogenous hTRAIL in hUC-MSC did not cause any significant change of expression of cell cycle regulators Cyclin D1 （1.19 fold， P = 0.141）， Cyclin E1 （0.94 fold，P = 0.745）， p21WAF1/CIP1（0.95 fold， P = 0.047）， and p27 （1.01 fold， P = 0.567） as compared with those of control viral infection. Conclusion We reported here an establishment of genetically engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells with overexpression of hTRAIL. Its anti-cancer therapeutic potential in vitro and in vivo is awaiting further investigation.

Genetically modified； umbilical cord； mesenchymal stem cell； TRAIL； cell Line， tumor

2015-07-08）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81272922）；福建省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)專題項(xiàng)目（2012YZ0001-1）

350025福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院福建省移植生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

王水良，Email： shuiliang.wang@xmu.edu.cn