馬鈴薯主要病毒及檢測研究進展

陳曉艷+齊恩芳+賈小霞+張武

摘 要 馬鈴薯是無性繁殖作物，常因病毒侵染而造成病毒在植株體內(nèi)累積，造成種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量下降?；诖耍v述了馬鈴薯的幾種常見病毒病，并對常用的病毒檢測方法進行評價。為保證馬鈴薯種薯質(zhì)量，促進馬鈴薯主糧化、優(yōu)化農(nóng)業(yè)結構提供技術指導。

關鍵詞 馬鈴薯;病毒檢測

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）27--04

馬鈴薯具有分布范圍廣、適應性強、產(chǎn)量高和用途廣泛等特點，是全球公認的全營養(yǎng)食物。隨著我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的啟動，對保障國家糧食安全、順應國人營養(yǎng)需求、緩解資源環(huán)境壓力，有著其他作物不可替代的作用。但馬鈴薯在生長期間易受多種病毒病侵染造成病毒性退化，使馬鈴薯的品質(zhì)和產(chǎn)量受到影響，造成的損失巨大?，F(xiàn)已研究出的侵染馬鈴薯的病毒有40多種[1]，危害我國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的主要病毒有馬鈴薯PVX、PVS、PVY、PVA、PVM、PLRV和PSTV[2，3]。這些病毒嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，馬鈴薯病毒的研究也成為各國研究的重點，馬鈴薯病毒的檢測成為馬鈴薯種薯繁育中的重大難題。

1 影響馬鈴薯的主要病毒類型

1.1 馬鈴薯X病毒（Potato Virus X，PVX）

馬鈴薯X病毒為害癥狀因品種、病毒株系以及環(huán)境條件的不同，有些株系在冷涼條件下，葉片出現(xiàn)輕微花葉，繼而發(fā)展成為褪綠斑、壞死性條斑，有的上部葉畸形，葉緣呈鋸齒等癥狀;晴朗天氣，明脈、輕微花葉癥狀可減輕，甚至完全消失;有些株系，在高溫條件下不表現(xiàn)癥狀，呈隱癥現(xiàn)象。PVX是由一條正鏈RNA組成的線性病毒，RNA 3，末端是多聚腺嘌呤核苷酸，5，末端有m7GppG“帽子”結構[4]。PVX單獨侵染馬鈴薯可減產(chǎn)15%左右，PVX可與多種病毒復合侵染，嚴重時造成馬鈴薯絕收。

1.2 馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）

馬鈴薯Y病毒?。≒VY）的田間癥狀復雜多變，不同的病毒株系引致的癥狀差異較大，初期出現(xiàn)明脈癥狀，后形成系統(tǒng)斑駁，葉脈兩側組織呈綠色帶狀斑，葉片基部癥狀較為明顯，病葉側脈呈灰褐色壞死，表現(xiàn)脈和莖的變褐壞死。PVY病毒粒子為彎曲線狀，RNA的5端為VPg，3端為Poly（A）[5]。依據(jù)基因序列和基因組學，PVY 分為PVYO、PVYN，PVYC及一系列PVYO/PVYN 重組型如PVYNTN和PVYN：O[6]。馬鈴薯侵染PVY后，通常減產(chǎn)越50%，當它與PVX或PVA病毒混合感染時，會造成馬鈴薯產(chǎn)生非常嚴重的皺縮花葉癥狀，植株短小，減產(chǎn)可達80%[7]。

1.3 馬鈴薯S病毒（Potato Virus S，PVS）

許多馬鈴薯品種都帶PVS，很多時候無病癥，卻出現(xiàn)明顯的花葉和壞死斑點，最初中上部葉片的葉脈間出現(xiàn)褪綠小斑點，周邊擴大后，呈花葉癥狀，褪綠部出現(xiàn)壞死斑點，嚴重時，葉面呈波狀，生長后期，中、下位葉片表面變?yōu)榍嚆~色。PVS存在著2個株系（PVSO和PVSA），PVS病毒還存在著對氣候差異產(chǎn)生適應性變異[8]。一般PVS單獨侵染時沒有明顯的癥狀，導致馬鈴薯減產(chǎn)10%～20%[9]。在大田PVS通常和其他病毒混雜感染，減產(chǎn)20%～30%[10]。

1.4 馬鈴薯卷葉病毒（Potato Leaf Roll Virus，PLRV）

植株感馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）病后，由下葉開始葉緣上卷，嚴重的呈管狀，卷葉波及到上部葉片，導致株高矮縮，葉色黃變，病株葡匐莖短，生成許多小型塊莖。PLRV靠蚜蟲以時間長、循環(huán)繁殖方式傳播，在寄主植株體內(nèi)主要局限在維管束內(nèi)[11]。由于韌皮部破壞，在莖橫切面可觀察到黑點，莖節(jié)部和基部尤為突出，塊莖組織則出現(xiàn)導管區(qū)網(wǎng)狀壞死斑紋，導致馬鈴薯品質(zhì)嚴重受損。PLRV是單鏈正義RNA病毒，屬黃化病毒組[12，13]?？稍斐神R鈴薯減產(chǎn)30%以上。

1.5 馬鈴薯A病毒（Potato Virus A，PVA）

馬鈴薯A病毒（PVA）是侵染馬鈴薯的主要病毒之一，其具有絲狀的病毒粒子，長730nm左右，直徑約15 nm。1914年，第一次出現(xiàn)了有關馬鈴薯A病毒病的病害癥狀的報道，正式命名直到1932年[14，15]。PVA通過汁液機械摩擦接種。薯塊可持久帶毒。依據(jù)不同種類和不同種植地區(qū)，侵染該病毒的馬鈴薯病葉將出現(xiàn)藥葉、葉面粗糙、邊緣波浪狀或不顯癥，一部分敏感的品種表現(xiàn)出頂端壞死。該病毒通常與PVY、PVX、PVM病毒混合侵，為皺縮狀，減產(chǎn)嚴重。

1.6 馬鈴薯皺縮花葉病毒（Potato Virus M，PVM）

馬鈴薯M病毒（PVM）有正單鏈RNA，發(fā)生在全國各地[16]。田間一般經(jīng)機械和蚜蟲傳播，常表現(xiàn)為葉片皺縮，全株矮化，還伴有葉脈透明，通常減產(chǎn)9%～49%。馬鈴薯M病毒主要借助于汁液摩擦傳毒。高海拔、低溫、晝夜溫差大的生態(tài)環(huán)境對病毒的繁殖有抑制作用。

1.7 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato Spindle Tuber Viroid，PSTV）

馬鈴薯紡錘塊莖病毒（PSTV）是影響我國北方馬鈴薯生產(chǎn)的嚴重病害之一。該病毒能影響塊莖的形狀，還能降低結薯的數(shù)量和大小。PSTV是一個非常小的單鏈RNA分子，只有核酸，無衣殼蛋白，有病原性的RNA，呈環(huán)狀。感病植株莖和花梗細長、上舉，或小葉變小，緣呈波狀，并向上卷曲，小葉扭曲，葉脈壞死和嚴重束頂。感病植株的塊莖變長，某些品種還會出現(xiàn)尖頭，病薯上的芽眼增多，凹陷，有較重的芽眉，也可能呈類似的紡錘塊莖狀。其通常會造成馬鈴薯減產(chǎn)20%～60%。PSTV很容易通過種薯（苗）、花粉、種子、機械摩擦或昆蟲等多種途徑傳播[17]。

2 馬鈴薯病毒檢測的方法

目前，主要運用莖尖脫毒繁育脫毒種薯來防治馬鈴薯病毒病，在脫毒種薯的繁殖過程中，保證種薯質(zhì)量的關鍵是對病毒進行快速準確的檢測?，F(xiàn)階段，馬鈴薯病毒檢測的方法有指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法、反轉錄-聚合酶鏈式反應等。

2.1 指示植物法

1929年，美國的病毒學家Holmes首先發(fā)現(xiàn)了指示植物檢測法[18]。其原理是對馬鈴薯上的某個病毒反應敏感，只要被侵染，指示植物可以超速的表現(xiàn)出明顯癥狀。該方法簡便可行，對儀器、藥品、深奧的理論知識要求低，空間足夠大、隔離條件良好、癥狀觀察經(jīng)驗豐富遍可操作，一般的研究單位、種薯生產(chǎn)公司均可掌握。但指示植物的培育需要占用很大空間、消耗很長時間，且靈敏度不高，這對于大批生產(chǎn)馬鈴薯試管苗的檢測不適用。

此方法已在PVS、PVY、PVX等病毒株系的檢測上廣泛運用，且用于分子生物學或血清學檢測之前的初步鑒定[19]。吳凌娟[20]等在2003年用多種指示植物分離鑒定PVX，結果說明千日紅是一種不錯的鑒定指示植物。常用的馬鈴薯病毒的指示植物及癥狀見表1。

2.2 反轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR）

PCR是體外擴增DNA的一種技術，絕大部分植物病毒是RNA病毒，需要將RNA反轉錄成cDNA然后PCR擴增，該方法是RT-PCR[21]。目前，該技術已應用于PMTV、PLRV、PVA等的檢測[22]。關翠萍[23]用一步RT-PCR法檢測出馬鈴薯中的PVY、PVX和PLRV，證明了該方法比兩步RT-PCR靈敏度高約100倍。Mumford[24]等用實時熒光RT-PCR法檢測了馬鈴薯PMTV、TRV，說明與常規(guī)RT-PCR檢測比靈敏度分別提高了100和10 000倍左右。

現(xiàn)在檢測馬鈴薯病毒用免疫試紙條法加RT-PCR法，先用試紙條免疫捕獲目標病毒，再取下試紙條上出現(xiàn)的檢測條帶作為模板直接進行RT-PCR，不僅省去了常規(guī)RT-PCR提取總RNA的繁瑣步驟，而且可以放大核酸信號，提高檢測靈敏度[25]。此項技術已在馬鈴薯PVX、PVY、PVS快速檢測上得到應用。但同時，RT-PCR檢測技術也存在些許問題，表2對RT-PCR中一些常見問題和解決方案進行了總結。

2.3 酶聯(lián)免疫檢測法（Enzyme-linked Immune Sorbent Assay，ELISA）

ELISA（Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay）技術是荷蘭學者Van Weeman、Schurrs和瑞典學者Engvall、Perman在20世紀70年代幾乎同時提出的[26-27]。ELISA的基本原理見圖1。

圖1 ELISA的基本原理

酶聯(lián)免疫檢測法具有高度的特異性;因酶在其與底物的反應中不被消耗，表現(xiàn)出高度的靈敏性;酶標記的試劑制備容易，結合物穩(wěn)定，而且有效期長;國際上許多權威機構將其列為優(yōu)先發(fā)展的分析技術之一[28-30]。但諸多因素均影響其取得成功，如材料的選擇、操作步驟的嚴謹?shù)龋灰幸粋€因素改變即可能會造成其他條件的改變，最終導致結果的準確性不夠，并且仍然存在不易檢測含量極少的韌皮部病毒等缺陷?，F(xiàn)階段，檢測食品中所含農(nóng)藥的殘留，國內(nèi)外有不少都用酶免疫技術。還有將其應用在現(xiàn)代醫(yī)學和食品檢驗學中的報道也很多。如吳凌娟[31]等將直接酶聯(lián)免疫吸附法和間接酶聯(lián)檢測法做了對比試驗，結果說明間接酶聯(lián)檢測法檢測病毒的靈敏度較直接酶聯(lián)免疫吸附法高。張仲凱[32]等在2003年用TAS-ELISA檢測馬鈴薯脫毒苗，并對幾種檢測方法進行比較，比較得出TAS-ELISA的靈敏度遠高于DAS-ELISA。

3 結論

本文介紹了幾種常見馬鈴薯的病毒病，歸納總結了馬鈴薯病毒檢測的常用方法，每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點，馬鈴薯是宜糧、宜菜、宜飼、宜做工業(yè)原料的多種用途經(jīng)濟作物，其退化的原因是病毒侵染，所以，具有快速、準確、靈敏的病毒檢測方法，增大對種薯的檢測強度，從源頭上控制種薯質(zhì)量，實現(xiàn)脫毒種薯的最全脫毒，是防治病毒侵染、提高產(chǎn)量的主要選擇?，F(xiàn)在防治馬鈴薯病毒病的發(fā)生主要是通過馬鈴薯病毒檢測，因此馬鈴薯病毒檢測的準確和成本對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有深刻的影響。馬鈴薯脫毒種薯繁育中應采用操作較為簡單的TAS-ELISA技術檢測馬鈴薯病毒，有條件的單位可以采用TAS-ELISA和RT-PCR技術結合的方法檢測馬鈴薯病毒，科研單位應積極研究免疫試紙條結合RT-PCR法快速檢測馬鈴薯病毒新方法，提高檢測靈敏度，降低馬鈴薯病毒檢測的費用。因此，病毒檢測技術還須向著降低成本與高靈敏度的方向發(fā)展。

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（責任編輯：趙中正）