甘蔗脫毒健康種苗中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因差異表達(dá)分析

王俊剛 趙婷婷 楊本鵬 蔡文偉 張樹(shù)珍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

甘蔗脫毒健康種苗中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因差異表達(dá)分析

王俊剛 趙婷婷 楊本鵬 蔡文偉 張樹(shù)珍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

旨在探討脫毒處理對(duì)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的影響，分析了3種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a在健康種苗和常規(guī)種苗不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示，在苗期和分蘗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a表達(dá)量高于未脫毒種苗；在拔節(jié)期和成熟期甘蔗脫毒健康種苗未成熟莖節(jié)中SGT1、SGT2和PST2a表達(dá)量也高于未脫毒種苗；而在成熟莖節(jié)中表達(dá)量沒(méi)有差異。苗期和分蘗期甘蔗葉片以及未成熟莖節(jié)中細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛，需要利用大量單糖以提供能源和生物合成的前體物質(zhì)。結(jié)果表明，該3種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量上升可能提供更多單糖用于細(xì)胞代謝，促進(jìn)脫毒健康種苗的快速生長(zhǎng)及最終生物量的積累。

甘蔗；健康種苗；單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；基因表達(dá)；產(chǎn)量

高等植物中源庫(kù)組織相互交織形成一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)整體。一些源組織如成熟葉片主要為糖類等有機(jī)物合成的場(chǎng)所，其合成的光合產(chǎn)物主要以蔗糖的形式運(yùn)輸至庫(kù)器官后，一部分儲(chǔ)存在薄壁細(xì)胞中，另外一部分在各種蔗糖代謝酶的作用下水解為單糖，并在單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下被庫(kù)器官所利用，從而為植物的生長(zhǎng)提供基本能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于易化因子超家族（Major facilitator superfamily）成員之一，是一種能量依賴性H+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有12次跨膜結(jié)構(gòu)，包括己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hexose transporter，HT）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glueose tansporter，GT）等，在植物碳水化合物分配、韌皮部裝載和卸載、植物防御以及糖信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)與植物生物量形成有密切的關(guān)系［1-3］。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是最為重要的糖料作物，是一種多年宿根無(wú)性繁殖栽培作物。多年種植尤其是宿根后，幾乎所有甘蔗品種在大規(guī)模應(yīng)用后均受到宿根矮化?。≧atoon Stunting Disease，RSD）和甘蔗花葉?。⊿ugarcane mosaic virus，SCMV）的危害，導(dǎo)致品種退化，造成甘蔗減產(chǎn)達(dá)10%，有的甚至高達(dá)50%［4，5］。目前，生產(chǎn)上尚無(wú)有效的化學(xué)方法防治這兩種病害。研究表明，采用熱處理結(jié)合腋芽分生組織培養(yǎng)技術(shù)培育的脫毒健康種苗是防治這兩種病害最有效的措施之一［6-10］。種植甘蔗脫毒健康種苗可以增產(chǎn)20%-40%［6-8］。從甘蔗農(nóng)藝性狀上對(duì)其增產(chǎn)機(jī)理研究比較多［8，9］，但更進(jìn)一步分子水平的增產(chǎn)機(jī)理還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用已報(bào)道的3個(gè)甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PST2a（Putative Sugar Transporter 2a，PST2a）、SGT1（Glucose Tansporter1，SGT1）和SGT2（Glucose Tansporter2，SGT2）為研究對(duì)象，分別從甘蔗生長(zhǎng)的苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，以期探討脫毒處理對(duì)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的影響，從分子生物學(xué)層面上揭示種植脫毒健康種苗可能的增產(chǎn)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為ROC22脫毒健康種苗二代種莖苗和未脫毒ROC22種莖。材料來(lái)源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗試驗(yàn)地。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取、定量及完整性檢測(cè) 取從10個(gè)完整植株剝離的凍存樣品進(jìn)行研磨，用RNAout試劑盒（北京天澤基因）試劑提取全部研磨樣品的總RNA以減少取樣誤差。用核酸分析儀（Eppendorf Biophotometer Plus）測(cè)260 nm和280 nm處的吸光值，以A260/A280比值估計(jì)總RNA的純度，以A260的值進(jìn)行總RNA定量。以1.2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 第一鏈 cDNA的合成 取甘蔗總RNA 3 μg與反轉(zhuǎn)錄引物（oligo-dT接頭引物）1 μL（10 pmol/L）混合，70℃加熱5 min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5 mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)過(guò)程為42℃ 60 min，70℃ 15 min，5 min后瞬時(shí)離心，最后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)公布的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SGT1（GenBank 登錄號(hào)：L21752）、SGT2（GenBank登錄號(hào)：L21753）、PST2a（GenBank登錄號(hào)：AY-165599）序列利用primer3設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參GADPH基因引物引自參考文獻(xiàn)［11］。

表1 引物序列、PCR擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度和擴(kuò)增效率

1.2.4 Real-Time PCR 擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析 選用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)建立25 μL熒光定量PCR 反應(yīng)體系：cDNA模板1μL，引物1、引物2各1 μL，RoxⅡ 0.5 μL，SYBR Taq 12.5 μL，dH2O 9 μL；反應(yīng)程序：95℃熱變性15 s；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在Mx3005P（Stratagene）上完成，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，擴(kuò)增效率見(jiàn)表1。以甘蔗GADPH基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有結(jié)果以2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)定量值［12］。

2 結(jié)果

2.1 RNA 純度鑒定

不同組織以及不同生長(zhǎng)時(shí)期的總RNA瓊脂糖凝膠電泳表明，28S和18S條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯降解；A260/A280比值皆在1.8-2.2之間，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2 苗期單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)分析

研究結(jié)果表明，3個(gè)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a在苗期甘蔗葉片中均有表達(dá)；在脫毒健康種苗未成熟葉片中表達(dá)量均明顯高于未脫毒種苗；在脫毒健康種苗成熟葉片中SGT1和SGT2表達(dá)量與對(duì)照無(wú)差異，PST2a基因表達(dá)量升高（圖1）。

圖1 甘蔗苗期不同組織SGT1、SGT2和PST2a基因相對(duì)表達(dá)量

2.3 分蘗期單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)分析

選擇甘蔗分蘗中期單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析。大約在甘蔗第一棵分蘗苗長(zhǎng)出7 d后，對(duì)主莖甘蔗進(jìn)行采樣，此時(shí)主莖甘蔗葉片光合效率高，需要大量合成有機(jī)化合物，隨后光合效率維持一段時(shí)間后，慢慢降低（數(shù)據(jù)未顯示）。研究結(jié)果（圖2）表明，SGT1、SGT2和PST2a在脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中的表達(dá)量較未脫毒種苗均大幅提高，表明脫毒處理可能使分蘗期甘蔗葉片中單糖利用效率提高，促進(jìn)植株的分蘗和快速生長(zhǎng)。

圖2 甘蔗分蘗期不同組織SGT1、SGT2和PST2a基因相對(duì)表達(dá)量

2.4 拔節(jié)期單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)分析

甘蔗拔節(jié)期為莖稈快速生長(zhǎng)時(shí)期，甘蔗最終生物量與此階段的快速生長(zhǎng)呈正相關(guān)。結(jié)果（圖3）表明，SGT1、SGT2和PST2a在拔節(jié)期甘蔗脫毒健康種苗葉片中表達(dá)量與未脫毒種苗差異不明顯；然而在莖節(jié)中的表達(dá)量差異卻呈現(xiàn)出一定的趨勢(shì)：在幼嫩未成熟1-3莖節(jié)中，表達(dá)量稍有提高；隨著莖節(jié)發(fā)育糖分的快速利用，到7-8節(jié)SGT1、SGT2和PST2a表達(dá)量均大幅提高；隨著莖節(jié)成熟表達(dá)量差異增幅逐漸變小或沒(méi)有差異，可能與甘蔗莖稈中單糖的利用效率呈正相關(guān)。

圖3 甘蔗拔節(jié)期不同組織SGT1（A）、SGT2（B）和PST2a（C）基因相對(duì)表達(dá)量

圖4 甘蔗成熟期不同組織SGT1（A）、SGT2（B）和PST2a（C）基因相對(duì)表達(dá)量

2.5 成熟期單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)分析

結(jié)果（圖4）表明，SGT1和PST2a在成熟期脫毒健康甘蔗種苗葉片中的表達(dá)量大幅增加，而SGT2表達(dá)量差異較?。籗GT1和SGT2在脫毒健康種苗未成熟莖節(jié)中表達(dá)量大幅提高，隨著莖節(jié)成熟表達(dá)量低于對(duì)照，然而PST2a在成熟期脫毒健康甘蔗種苗莖稈中的表達(dá)量與未脫毒種苗沒(méi)有差異。表明該3種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在不同組織中參與調(diào)控單糖的分配及利用。

3 討論

植物單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是調(diào)控生物量的一類重要蛋白［13］。在多種植物中均存在多基因現(xiàn)象，并且在不同植物中基因成員數(shù)及不同部位表達(dá)量也有所不同。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能是通過(guò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)其生理學(xué)功能［14-16］。水稻單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsMST6在種子灌漿中期表達(dá)量達(dá)到最高，隨著種子成熟逐漸降低，主要表達(dá)部位在幼嫩種子維管薄壁組織的珠心和胚乳、花粉、花藥以及葉片葉肉細(xì)胞中，推測(cè)OsMST6可能與種子形成及產(chǎn)量有相關(guān)性［17］；水稻OsMST4 在種子灌漿期早期和中期表達(dá)量最高，隨后降低，擬推測(cè)其重要功能為種子形成供應(yīng)單糖［18］；擬南芥單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STP1和STP13在根部表達(dá)，能夠從根的周?chē)仗欠郑?9］；通過(guò)提高擬南芥單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TMT1表達(dá)量能夠增加其種子的生物量［13］。各種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異表達(dá)量和組織特異性表達(dá)，也決定了其在植物不同發(fā)育階段發(fā)揮不同的作用。此外，單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與植物防御過(guò)程，通?；虮磉_(dá)受到病原菌入侵的調(diào)控［3］。

種植甘蔗脫毒健康種苗通常能夠增產(chǎn)20%以上，其增產(chǎn)機(jī)理在田間主要表現(xiàn)為分蘗強(qiáng)、生長(zhǎng)快、成莖率高等性狀［8］。然而進(jìn)一步從分子生物學(xué)方面對(duì)其可能的增產(chǎn)機(jī)理的研究報(bào)道較少，特別是關(guān)于單糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。植物中單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常與單糖的快速利用和分配相關(guān)。在生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂旺盛的細(xì)胞及組織中通常對(duì)單糖的需求高，因此也需要較多的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與。本研究表明，甘蔗SGT1、SGT2和PST2a基因在脫毒健康種苗苗期和分蘗期葉片中的表達(dá)顯著高于未脫毒種苗，表明脫毒處理可能使得這一生長(zhǎng)階段甘蔗葉片中單糖利用提高，促進(jìn)葉片及整株植株的快速生長(zhǎng)發(fā)育，這也可能為脫毒健康種苗的強(qiáng)分蘗提供更多的單糖而被加以利用。SGT1、SGT2和PST2a在拔節(jié)期脫毒健康種苗快速生長(zhǎng)1-8莖節(jié)中的表達(dá)明顯高于對(duì)照，可能有利于莖節(jié)的快速生長(zhǎng)，為其提供更多的單糖以及纖維素合成前體底物，因此進(jìn)一步需要更多的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)增強(qiáng)對(duì)單糖的利用。SGT1和SGT2在脫毒健康種苗成熟期1-8節(jié)莖節(jié)中大量表達(dá)，有利于未成熟莖節(jié)增粗，增加產(chǎn)量；同時(shí)在成熟莖節(jié)中表達(dá)量降低，降低了對(duì)單糖的利用，促進(jìn)蔗糖的積累，提升甘蔗品質(zhì)。通過(guò)對(duì)整個(gè)生長(zhǎng)期脫毒健康種苗和非脫毒苗中的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因差異表達(dá)研究表明：?jiǎn)翁寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量與甘蔗脫毒健康種苗的產(chǎn)量形成呈正相關(guān)；該3種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)可能受到甘蔗病害的抑制，進(jìn)一步預(yù)測(cè)它們可能有利于甘蔗的產(chǎn)量形成。

4 結(jié)論

本研究采用Real-Time PCR技術(shù)分析了甘蔗脫毒健康種苗和常規(guī)種苗中3種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量差異。研究結(jié)果表明：（1）在苗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中PST2a基因表達(dá)高于未脫毒種苗；SGT1和SGT2基因在未成熟葉片中表達(dá)高于未脫毒種苗。（2）在分蘗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a表達(dá)量均明顯高于對(duì)照。（3）在拔節(jié)期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a基因表達(dá)與對(duì)照沒(méi)有差異；而在未成熟莖節(jié)中SGT1、SGT2和PST2a基因表達(dá)量都明顯高于對(duì)照，隨著莖節(jié)成熟表達(dá)量差異逐漸縮小。（4）在成熟期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1和PST2a基因表達(dá)量比對(duì)照高；未成熟莖節(jié)中SGT1和SGT2基因表達(dá)量高于對(duì)照，而成熟莖節(jié)中表達(dá)量沒(méi)有差異。

［1］ 王俊剛， 趙婷婷， 張樹(shù)珍， 等. 植物單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［J］. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（6）：1195-1200.

［2］ Wormit A， Trentmann O， Feifer I， et al. Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport［J］. The Plant Cell， 2006， 18（12）：3476-3490.

［3］ Slewinski TL. Diverse functional roles of monosaccharidetransporters and their homologs in vascular plants：a physiological perspective［J］. Mol Plant， 2011， 4（4）：641-662.

［4］Flynn JL， Anderlini TA. Disease incidence and yield performance of tissue culture generated seedcane over the crop cycle in Louisiana［J］. Sugar Azucar， 1989， 80：20.

［5］Hendre RA， Mascarenhas AF， Nadgir AL， et al. Growth of mosaic virus-free sugarcane plants from apical meristems［J］. Indian Pathology， 1975， 28：185-198.

［6］Leu LS. Apical meristem culture and redifferentiation of callus masses to free some sugarcane systemic disease［J］. Plant Protection Bulletin， 1978， 20：77-82.

［7］Lee TSG. Micropropagation of sugarcane（Saccharum spp. ）［J］. Plant Cell Tissue Organ Cult， 1991， 10：47-55.

［8］楊本鵬， 張樹(shù)珍， 蔡文偉， 等. 甘蔗健康種苗田間栽培主要農(nóng)藝性狀比較［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 2（31）：117-175.

［9］ 游建華， 曾慧， 李松， 等. 甘蔗脫毒健康種苗田間比較試驗(yàn)［J］.中國(guó)糖料， 2005， 2：12-15.

［10］楊本鵬. 糖料甘蔗栽培［M］. 海口：南方出版社.

［11］Iskandar HM， Simpson SR， Casu RE， et al. Comparison of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of gene expression in sugarcane［J］. Plant Mol Biol Rep， 2004， 2（22）：325-337.

［12］Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod［J］. Methods， 2001， 25：402-408.

［13］Wingenter K， Schulz A， Wormit A， et al. Increased activity of the vacuolar monosaccharide transporter TMT1 alters cellular sugar partitioning， sugar signaling， and seed yield in Arabidopsis［J］. Plant Physiol， 2010， 154（2）：665-677.

［14］Johnson DA， Hill JP， Thomas MA. The monosaccharide transporter gene family in land plants is ancient and shows differential subfamily expression and expansion across lineages［J］. BMC Evol Biol， 2006， 6：64.

［15］Buttner M. The monosaccharide transporter（-like）gene family in Arabidopsis［J］. FEBS Letters， 2005， 81（12）：2318-2324.

［16］Lalonde S， Frommer WB. SUT sucrose and MST monosaccharide transporter inventory of the Selaginella genome［J］. Trends Plant Sci， 2012， 3：24.

［17］Wang Y， Xiao Y， Zhang Y， et al. Molecular cloning， functional characterization and expression analysis of a novel monosaccharide transporter gene OsMST6 from rice（Oryza sativa L. ）［J］. Planta， 2008， 228（4）：525-535.

［18］Wang Y， Xu H， Wei X， et al. Molecular cloning and expression analysis of a monosaccharide transporter gene OsMST4 from rice（Oryza sativa L. ）［J］. Plant Mol Biol Rep， 2007， 65（4）：439-451.

［19］Yamada K， Kanai M， Osakabe Y， et al. Monosaccharide absorption activity of Arabidopsis roots depends on expression profiles of transporter genes under high salinity conditions［J］. J Biol Chem，2011， 286（50）：43577-43586.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Differential Expression of Monosaccharide Transporter Genes in Disease-free Sugarcane Plants

Wang Jungang Zhao Tingting Yang Benpeng Cai Wenwei Zhang Shuzhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

The sugarcane yield can be increased by planting disease-free sugarcane seedlings. However， the physiological and molecular mechanisms of this yield increasing are still not clear now. Monosaccharide transporters are one type of key regulatory proteins involved in carbon accumulation and partitioning processes， and play an important role in plants defense process. The differential expression of three monosaccharide transporter genes（SGT1， SGT2 and PST2a）in disease-free and untreated sugarcane plants was studied to clarify the potential function of these genes on sugarcane yields. The expression levels of SGT1， SGT2 and PST2a in leaves of disease-free plants at seedling and tillering stages were obviously higher than untreated plants. Furthermore， the expression levels of these genes were increased in immature internodes of disease-free plants at elongation and mature stages， but there were no difference in mature internodes. The sugarcane leaves（at seedling and tillering stages）and the immature internodes（at elongation and mature stages）grow rapidly and demand for more monosaccharide to provide energy and the precursor of biosynthesis. The up-regulations of these monosaccharide transporter genes might accelerate the growth and biomass accumulation of disease-free sugarcane plants by increasing the transporting and uptake of monosaccharide.

sugarcane；disease-free plants；monosaccharide transporter gene；gene expression；yield

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.016

2014-09-04

“863”計(jì)劃（2013AA102604-1），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（313078），海南省重大科技項(xiàng)（ZDZX2013023-1）

王俊剛，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：wangjungang@itbb.org.cn

張樹(shù)珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：zhangsz2007@163.com