微生物法生產(chǎn)L-絲氨酸代謝工程研究進(jìn)展

劉巖王慧史吉平趙志軍叢麗娜

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連　116034；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院　生物煉制實(shí)驗(yàn)室，上?！?01210）

微生物法生產(chǎn)L-絲氨酸代謝工程研究進(jìn)展

劉巖1，2王慧2史吉平2趙志軍2叢麗娜1

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連116034；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院生物煉制實(shí)驗(yàn)室，上海201210）

L-絲氨酸是生物體內(nèi)一種重要的中間代謝產(chǎn)物，為甘氨酸等多種氨基酸、核苷酸、膽堿、磷脂的合成前體，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。L-絲氨酸的生產(chǎn)方法有蛋白質(zhì)水解提取法、化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法具有原料廉價(jià)、環(huán)境污染小、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)。系統(tǒng)綜述了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸所涉及的代謝工程策略，包括微生物合成L-絲氨酸的各種代謝調(diào)控機(jī)制及相應(yīng)采取的改造措施和效果，并探討了L-絲氨酸育種技術(shù)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

L-絲氨酸；代謝工程；微生物發(fā)酵法

L-絲氨酸（L-Serine，L-Ser）作為一種組成蛋白的基本氨基酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)。此外，以 L-Ser為原料還能合成20余種具有抗癌、抗艾滋、調(diào)節(jié)人體神經(jīng)系統(tǒng)等不同效用的藥物。目前L-Ser的全球市場(chǎng)需求量為10 000 t/年，市場(chǎng)潛力巨大［1，2］。

然而，與不斷增大的L-Ser市場(chǎng)需求相比，L-Ser的生產(chǎn)技術(shù)卻較為落后［3-5］。目前，工業(yè)上采用的L-Ser生產(chǎn)方法主要有蛋白水解法［6］、化學(xué)合成法［7］和酶轉(zhuǎn)化法［8］等，其中蛋白水解法存在工藝復(fù)雜、分離精制困難等缺點(diǎn)；化學(xué)合成法存在污染重、D-Ser與L-Ser分離困難等缺點(diǎn)；酶轉(zhuǎn)化法是目前國(guó)際上普遍采用的方法，具有反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在轉(zhuǎn)化率偏低、前體物（甘氨酸等）昂貴等難題。因此盡快開(kāi)發(fā)污染小、成本低、效率高的微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-Ser，顯得極為重要。值得注意的是，由于微生物合成L-Ser的代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，特別是存在眾多的L-Ser向其他氨基酸的轉(zhuǎn)化途徑，導(dǎo)致L-Ser在體內(nèi)很難得到積累。本文系統(tǒng)綜述了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-Ser所涉及的代謝工程策略，并探討了其未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。

1 L-絲氨酸的微生物合成機(jī)制

1.1 微生物合成L-絲氨酸的代謝途徑

目前用于生產(chǎn)L-Ser的微生物種類主要有大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，兩種微生物的L-Ser合成代謝機(jī)制基本相同，以大腸桿菌為例，起始物葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP）途徑中的3-磷酸甘油酸（3-Phosphoglycerate，3-PG）進(jìn)入L-Ser分支途徑；在L-Ser分支途徑中，3-PG經(jīng)磷酸甘油酸脫氫酶（SerA）催化合成3-磷酸-羥基丙酮酸（3-phosphonooxypyruvate，3-PHP），再途經(jīng)中間產(chǎn)物3-磷酸絲氨酸（3-phosphoserine，Ser-P）后合成L-Ser；此外，中間產(chǎn)物Ser-P的合成還需要L-谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）作為前體物提供氨基（圖1）。

1.2 微生物合成L-絲氨酸的調(diào)控機(jī)制

微生物通過(guò)各種調(diào)控機(jī)制控制體內(nèi)L-Ser的合成代謝。

1.2.1 限速酶的反饋抑制 在L-Ser分支途徑中，催化3-磷酸-羥基丙酮酸（3-PHP）合成的磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH）受到L-Ser的嚴(yán)格反饋調(diào)控，當(dāng)胞內(nèi)的L-Ser濃度達(dá)到30 μmol/L時(shí)，PGDH的殘留酶活僅有不含L-Ser時(shí)的15%-17%［9］，控制著由EMP途徑進(jìn)入L-Ser分支途徑的碳流量。

1.2.2 降解轉(zhuǎn)化途徑調(diào)控 盡管L-Ser的主要合成途徑較為簡(jiǎn)短，但值得注意的是，微生物體內(nèi)存在L-Ser降解途徑及轉(zhuǎn)化為多種其他氨基酸的途徑，如L-Ser經(jīng)絲氨酸脫水酶（L-serine dehydratase，L-serDH）催化可降解為丙酮酸（Pyruvate，PYR）；經(jīng)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT）催化生成L-甘氨酸（L-glycine，L-Gly），然后L-Gly經(jīng)酶催化又可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蘇氨酸（L-threonine，L-Thr）和L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）等氨基酸。此外，在相關(guān)酶的催化作用下L-Ser還參與L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）和L-色氨酸（L-tryptophan，L-Trp）的合成反應(yīng)。因此，胞內(nèi)L-Ser極易轉(zhuǎn)化為其他的氨基酸或化合物，導(dǎo)致其積累困難（圖2）。

圖1 微生物產(chǎn)L-絲氨酸的合成途徑及相關(guān)調(diào)控

圖2 大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌L-絲氨酸的降解轉(zhuǎn)化途徑示意圖

1.2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑調(diào)控 在微生物體內(nèi)，許多氨基酸的分泌與吸收依靠特定的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)完成。目前L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究仍處于初級(jí)階段，僅依靠生理生化特征發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)與L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白，例如大腸桿菌中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CycA 屬于生物體內(nèi)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、多胺及金屬陽(yáng)離子有機(jī)物（Amino acid-polyamine-organocation，APC）超家族的成員，其主要負(fù)責(zé)丙氨酸由培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，但研究發(fā)現(xiàn)CycA同時(shí)也參與調(diào)控菌體對(duì)L-Ser和L-Gly的吸收［10］；來(lái)源于DAACS［Cation（Na+or H+）Symporter family］家族的SstT同時(shí)調(diào)控L-Thr和L-Ser的吸收［11］；而透酶TdcC主要負(fù)責(zé)L-Thr的吸收，但競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明其也參與絲氨酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，蛋白TdcC僅在厭氧條件下參與調(diào)控L-Ser的吸收［12，13］。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，僅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SdaC被認(rèn)為是專一性調(diào)控L-Ser吸收［14，15］。此外，對(duì)于L-Ser的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，目前僅研究發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)L-Thr分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ThrE同時(shí)也參與調(diào)控L-Ser的分泌［16］。

2 應(yīng)用代謝工程改造L-絲氨酸合成途徑

目前微生物產(chǎn)L-Ser的代謝工程研究策略主要有：抗反饋抑制作用酶的篩選、合成L-Ser關(guān)鍵酶的過(guò)量表達(dá)，L-Ser降解轉(zhuǎn)化途徑的改造和L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的改造等（圖3）。

2.1 L-Ser分支途徑的改造

L-Ser分支途徑的改造主要包括關(guān)鍵酶磷酸甘油酸脫氫酶抗反饋抑制突變體的篩選以及系列關(guān)鍵酶基因的克隆表達(dá)?？狗答佉种谱饔猛蛔凅w的獲得是微生物積累L-Ser的先決條件。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)通過(guò)解析磷酸甘油酸脫氫酶蛋白SerA的三維晶體結(jié)構(gòu)，定向突變與其效應(yīng)物L(fēng)-Ser結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，從而獲得了一系列抗反饋調(diào)節(jié)的磷酸甘油酸脫氫酶突變體SerAFbr（Feedbackinhibition-resistant，F(xiàn)br）［17-19］。例如，大腸桿菌SerA的調(diào)控域位于蛋白的C末端，研究發(fā)現(xiàn)完全去除蛋白的調(diào)控域（氨基酸殘基337-410），可獲得抗反饋調(diào)節(jié)的SerAFbr，但同時(shí)酶蛋白由四聚體轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w［17］；而Grant 等［18］僅將SerA調(diào)控域中與L-Ser結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基H344和N346突變?yōu)楸彼幔↙-alanine，L-Ala），同樣解除了L-Ser的反饋調(diào)控作用。在谷氨酸棒桿菌中，Peters-Wendisch等［20］通過(guò)缺失SerA蛋白末端197個(gè)氨基酸殘基獲得了抗反饋調(diào)節(jié)的突變株SerAFbr。

L-Ser分支途徑的改造還涉及抗反饋調(diào)節(jié)作用酶SerAFbr和其他關(guān)鍵酶編碼基因（serC、SerB、pgk）的克隆表達(dá)，從而增強(qiáng)該途徑的碳源流量。例如，在谷氨酸棒桿菌中過(guò)量共表達(dá)基因serAfbrserC和serB［21］；在大腸桿菌中serAfbr的重組表達(dá)及其與催化3-PG合成的酶蛋白基因pgk的共表達(dá)［22］。

圖3 微生物產(chǎn)L-絲氨酸的代謝工程研究策略

2.2 L-Ser降解轉(zhuǎn)化途徑的改造

與終端氨基酸不同，L-Ser處于微生物合成代謝的中間環(huán)節(jié)，在細(xì)胞內(nèi)L-Ser瞬間被降解為PYR或轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-Gly、L-Thr、L-Trp和L-Cys等其他氨基酸，導(dǎo)致其難以積累；且L-Gly等轉(zhuǎn)化氨基酸作為一碳單元直接參與菌體的生長(zhǎng)，直接切斷這些途徑會(huì)嚴(yán)重影響微生物的生長(zhǎng)。因此轉(zhuǎn)化途徑的改造是L-Ser育種研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

Peters-Wendisch等［21］單獨(dú)敲除菌株ATCC 13032基因組上催化L-Ser向PYR轉(zhuǎn)化的絲氨酸脫水酶L-serDH編碼基因sdaA，菌株可積累8.4×10-3g/L的L-Ser；在共表達(dá)基因serAFbrBC的基礎(chǔ)上，敲除基因sdaA，菌株可積累4.6×10-2g/L的L-Ser；而進(jìn)一步降低催化L-Ser向L-Gly轉(zhuǎn)化的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT編碼基因glyA的表達(dá)強(qiáng)度后，L-Ser的積累量快速提高至9.03 g/L；由于在四氫葉酸的參與下L-Ser才能轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-Gly，因此Stolz等［3］進(jìn)一步敲除了四氫葉酸前體物葉酸的關(guān)鍵酶基因pabABC，L-Ser產(chǎn)量提高至36.3 g/L，這是目前文獻(xiàn)報(bào)道的直接發(fā)酵法產(chǎn)L-Ser的最高產(chǎn)量。國(guó)內(nèi)來(lái)書(shū)娟等［22］在共表達(dá)SerAFbr和pgk的基礎(chǔ)上，敲除了菌株ATCC 13032基因組上的sdaA基因和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT的調(diào)控基因glyR，菌株可積累4.5×10-2g/L的L-Ser。在大腸桿菌方面，Li 等［23］在基因組上同時(shí)敲除了催化L-Ser向PYR轉(zhuǎn)化的3個(gè)相關(guān)基因sdaA、sdaB 和 tdcG，當(dāng)在此菌株中過(guò)量表達(dá)SerAFbr時(shí)，可積累L-Ser 13.6×10-3g/g細(xì)胞干重。

2.3 L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的改造

轉(zhuǎn)運(yùn)途徑改造是氨基酸育種研究的一個(gè)重要手段，通過(guò)提高胞內(nèi)氨基酸的分泌速率或者降低胞外氨基酸的吸收速率，均可以有效促進(jìn)氨基酸在胞外的積累。盡管目前L-Ser的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)研究仍處于生化與分子鑒定的階段，但相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果仍顯示出L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要性。如Ogawa等［13］在大腸桿菌中缺失突變了L-Ser的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因sstT，發(fā)現(xiàn)該菌株無(wú)法在以L-Ser為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但當(dāng)在該菌株中過(guò)量表達(dá)另外一個(gè)L-Ser吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因tdcC時(shí)，菌體的生長(zhǎng)得以恢復(fù)。此外，Simic等［16］發(fā)現(xiàn)當(dāng)在谷氨酸棒桿菌中過(guò)量表達(dá)分泌轉(zhuǎn)運(yùn)基因thrE時(shí)，L-Ser分泌速度與野生型相比提高了36%；而當(dāng)在谷氨酸棒桿菌中缺失突變基因thrE時(shí)，L-Ser分泌速度與野生型相比降低了57%。

2.4 L-Ser合成代謝的發(fā)酵調(diào)控

微生物培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)環(huán)境條件的變化均會(huì)引起微生物合成代謝的變化，從而直接或間接調(diào)控著胞內(nèi)L-Ser的合成代謝，因此針對(duì)性地優(yōu)化發(fā)酵條件同樣是改善L-Ser合成代謝的重要措施。例如張曉娟等［24］考察了維生素對(duì)谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響，結(jié)果表明添加450 μg/L的VB1時(shí)，菌體L-Ser的積累量提高了28%；而添加0.4 μg/L的VB12時(shí)，菌體L-Ser的積累量提高了82%。此外，魏東等［25］對(duì)一株誘變改良過(guò)的黃色短桿菌進(jìn)行碳氮源優(yōu)化，L-Ser產(chǎn)量提高了84%，達(dá)到30.1 g/L。

3 展望

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在代謝工程改造L-Ser合成代謝的研究中進(jìn)行了大量的工作并取得了一些重要的研究成果。然而，借鑒近年來(lái)代謝工程策略在L-纈氨酸（L-valine，L-Val）［26，27］、L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）［28，29］和L-色氨酸（L-tryptophan，L-Trp）［30，31］等氨基酸菌種選育研究中的成功應(yīng)用，目前L-Ser的代謝工程研究仍存在一些不足之處。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者僅根據(jù)已有的信息或經(jīng)驗(yàn)對(duì)L-Ser分支途徑及L-Ser降解轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行分子改造，而相關(guān)文獻(xiàn)表明除合成途徑外，目標(biāo)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、EMP及HMP途徑，甚至全局調(diào)控因子等的定向改造同樣有利于目標(biāo)氨基酸的積累。如Wiriyathanawudhiwong 等［32］過(guò)量表達(dá)L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）的分泌蛋白TolC后，培養(yǎng)液中L-Cys的積累量提高1倍以上；Zhao 等［31］將色氨酸吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)基因mtr和tnaB敲除后，L-Trp產(chǎn)量提高27%；而Tatarko等［33］通過(guò)敲除全局調(diào)控因子csrA，明顯增加了L-苯丙氨酸分支途徑的碳源流量。

此外，微生物合成氨基酸是一個(gè)復(fù)雜的代謝調(diào)控過(guò)程，當(dāng)一個(gè)限速因子被消除時(shí)，合成代謝中往往就會(huì)次生出一些新的限速因子［34］，因此在根據(jù)已有信息進(jìn)行分子改造后，對(duì)合成代謝進(jìn)行全局性的分析，加深對(duì)L-Ser合成代謝調(diào)控機(jī)制的理解，以及確定次生出的限速因子等，對(duì)進(jìn)一步有效改造L-Ser合成代謝，選育優(yōu)良L-Ser生產(chǎn)菌株顯得尤為重要。令人鼓舞的是隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)、代謝產(chǎn)物濃度3個(gè)層次上對(duì)微生物體內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的合成代謝進(jìn)行全局立體式的分析，且這些技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于其他工業(yè)微生物菌種的選育研究中［35-37］。Lee 等［35］對(duì)L-Thr生產(chǎn)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與乙醛酸循環(huán)相關(guān)的基因aceBA的轉(zhuǎn)錄水平異常上調(diào)，通過(guò)分子手段進(jìn)一步增強(qiáng)aceBA的表達(dá)水平后，L-Thr產(chǎn)量提高30%。趙志軍［36］研究3種基因型△trpR.tnaA、△trpR.tnaA.pheA和△trpR.tnaA.pheA.mtr下大腸桿菌L-Trp合成代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝中間產(chǎn)物的濃度變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，赤蘚糖-4-磷酸和L-Ser的濃度遠(yuǎn)低于相應(yīng)分支途徑中其他代謝中間產(chǎn)物的濃度，推測(cè)赤蘚糖-4-磷酸和L-Ser為L(zhǎng)-Trp合成的潛在限速節(jié)點(diǎn)。Yin等［37］對(duì)誘變產(chǎn)L-Ile的谷氨酸棒桿JHI3-156進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平變化較大的蛋白：MetX、PrpC2和Sod等均不在L-異亮氨酸的合成途徑上，表明L-Ile的高產(chǎn)原因并非通過(guò)增強(qiáng)關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，可能存在其他的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，為了進(jìn)一步提高發(fā)酵法生產(chǎn)L-Ser的效率，今后L-Ser代謝工程研究的工作重點(diǎn)在于（1）采用分子手段，在保證菌體正常生長(zhǎng)代謝的情況下，進(jìn)一步降低絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT的酶活，減少L-Ser向L-Gly的轉(zhuǎn)化量，促進(jìn)L-Ser在胞內(nèi)的積累；（2）L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的分子鑒定以及通過(guò)缺失L-Ser吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因或過(guò)量表達(dá)L-Ser分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因，增加發(fā)酵培養(yǎng)液中L-Ser的積累效率；（3）通過(guò)組學(xué)分析技術(shù)探尋L-Ser合成代謝中的潛在限速因子，并采取針對(duì)性的分子改造措施加以消除；（4）分子改造磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）和乙酸合成途徑，調(diào)控菌株對(duì)葡萄糖的吸收速率，減少副產(chǎn)物乙酸等的積累，進(jìn)而提高L-Ser的轉(zhuǎn)化得率；（5）進(jìn)一步從底物及其他營(yíng)養(yǎng)因子的流加方式、發(fā)酵溫度等方面優(yōu)化L-Ser基因工程菌的發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)L-Ser的高密度高效發(fā)酵，提高L-Ser的生產(chǎn)強(qiáng)度。

總之，巨大的市場(chǎng)潛力已經(jīng)為L(zhǎng)-Ser育種技術(shù)的發(fā)展提供了源源不斷的動(dòng)力，而DNA重組技術(shù)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等代謝分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，必然會(huì)加速推進(jìn)微生物產(chǎn)L-絲氨酸的代謝工程研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on M etabolic Engineering for M icrobial Production of L-serine

Liu Yan1，2Wang Hui2Shi Jiping2Zhao Zhijun2Cong Li’na1
（1. School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian116034；2. Lab of Biorefinery，Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai201210）

L-serine is an important intermediate metabolite as a metabolic precursor to L-glycine and many other amino acids，nucleotides， choline， and phospholipids in organisms， and it has been widely used in medicine， food， cosmetics and other industries. The methods of producing L-serine include protein hydrolysis， chemical synthesis， enzymatic/microbial conversion and microbial fermentation， among which microbial fermentation has some advantages such as low cost of raw material， less environmental pollution， and high purity of product， etc. The strategies of metabolic engineering for improving L-serine production are reviewed， including the regulatory mechanisms and genetic modification of L-serine biosynthesis， as well the modified measures and subsequent effects. Furthermore， the prospect of L-serine breeding technologies is also discussed.

L-serine； metabolic engineering； microbial fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.007

2014-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31300048）

劉巖，女，碩士研究生，研究方向：微生物基因工程；E-mail：liuyan880319@126.com

叢麗娜，女，博士，研究方向：微生物基因工程；E-mail：linacong@163.com