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    SRB法檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用

    2015-10-22 11:15:56黃金蘭等
    科技視界 2015年30期
    關(guān)鍵詞:毒性

    黃金蘭等

    【摘 要】目的:研究沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。方法:SRB法體外檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性。結(jié)果:不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用,且呈劑量依賴性。結(jié)論:1.25μg/mL~5μg/mL濃度范圍沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

    【關(guān)鍵詞】沒食子酸乙酯;PC12;毒性

    在阿爾茨海默?。ˋD)患者腦組織中普遍存在著神經(jīng)氧化損傷,AD病人腦中表現(xiàn)出異常高的氧化修飾蛋白、脂類和DNA水平,保護(hù)神經(jīng)元免受氧化脅迫并在尋找合適的抗氧化劑,是防治AD的有效手段。沒食子酸乙酯是一種用于油脂的抗氧化劑、食品添加劑及某些藥品的中間體,據(jù)報(bào)道,沒食子酸乙酯具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用,但同時(shí)在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y也有一定的毒性[1],本研究擬以沒食子酸乙酯為研究對(duì)象,體外評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12的毒性作用。

    1 材料

    1.1 藥物、細(xì)胞株與主要試劑

    沒食子酸乙酯(購自阿拉丁,E119029);小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12(上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫);Sulforhodamine B(Sigma,批號(hào)230162),胚胎牛血清(FBS,Thermo,批號(hào)SV30087.02);DMEM(Life,12800-017)。

    1.2 主要儀器

    CO2培養(yǎng)箱(Thermo,型號(hào):3111),倒置顯微鏡(Olympus,型號(hào):IX53),酶標(biāo)儀(Bio Tek,型號(hào):Elx808)

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    PC12細(xì)胞置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,0.25%胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    2.2 SRB法檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞,胰酶消化,調(diào)整濃度為10000個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板,100μL/孔,24h后加入含不同濃度沒食子酸乙酯培養(yǎng)液,對(duì)照組加入等體積溶劑培養(yǎng)液,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔(重復(fù)3次),置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,終止時(shí)棄培養(yǎng)液,加入100μL預(yù)冷的10%TCA固定,4℃冰箱置1h。棄固定液,清水洗3次,甩干干燥,每孔加入100μL0.4%SRB室溫作用30min,用1%冰醋酸洗去游離染料。甩干干燥,每孔加入100μL10mM Tris溶解,放搖床直至染料全部溶解。最后用酶標(biāo)儀在564nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。細(xì)胞抑制率%=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD/對(duì)照組平均OD)×100%

    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以x±s表示。組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

    3 結(jié)果

    由表1結(jié)果顯示,不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用,并隨濃度增加,抑制率增大即細(xì)胞存活個(gè)數(shù)越少(圖1),其中1.25μg/mL~5μg/mL濃度范圍對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

    4 討論

    磺基羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料,可與生物大分于中的堿性氨基酸結(jié)合,其顏色變化與活細(xì)胞蛋白成正比。SRB法不僅具備MTT法操作簡(jiǎn)便、敏感的特點(diǎn),而且測(cè)量結(jié)果不受時(shí)間影響,特別適用于大規(guī)模藥物篩選及毒性評(píng)價(jià)。

    PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株,屬神經(jīng)嵴源性,具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征,且具可傳代特點(diǎn),能夠代替原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞[2],廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理、藥理學(xué)研究。

    沒食子酸乙酯作為一種抗氧化劑,神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用,但其有一定細(xì)胞毒性,本研究采用SRB法進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用,且呈劑量依賴性,其中1.25μg/mL~5μg/mL濃度范圍對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

    【參考文獻(xiàn)】

    [1]田偉,畢玉婷,周啟龍,等.沒食子酸酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25:1423-1427.

    [2]黃文超,李云峰,羅質(zhì)璞.單胺遞質(zhì)對(duì)皮質(zhì)酮所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(1):103-106.

    [責(zé)任編輯:湯靜]

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