RNA干擾技術的研究及進展

榮晶晶 和姬苓

【摘要】RNA干擾是近幾年興起的一種新技術，它是由雙鏈核糖核酸引起的抑制基因表達的一種現(xiàn)象。這種新技術在抗病毒、抗癌癥和基因病等醫(yī)學領域表現(xiàn)出了廣闊的應用前景。本文就RNA干擾的作用機制 、研究進展進行綜述。

【關鍵詞】RNA干擾技術 基因沉默 研究進展

【中圖分類號】R9145 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0645-01

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高效特異地阻斷基因表達的新技術。RNAi 是指一些小的雙鏈 RNA（dsRNA）在細胞內(nèi) Dicer 內(nèi)切酶的識別、結(jié)合、酶切下，產(chǎn)生有活性的長度為 21～23nt 干擾性 RNA（short interfering RNA ，siRNA），與互補的目的基因的 mRNA 結(jié)合并使之降解，從而到達抑制目的基因表達的作用，是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的“基因沉默”現(xiàn)象。本文旨在講述RNA干擾的作用機制及研究進展。

1. RNA干擾技術的作用機制

RNAi是指細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈 RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致該mRNA發(fā)生特異性降解從而導致基因表達沉默的現(xiàn)象[1]。其作用機制是：外源性 （如病毒）或內(nèi)源性的dsRNA在細胞內(nèi)與一種具有dsRNA特異性的RNA酶Ⅲ內(nèi)切核酸酶 （RNaseUIendnuclease）——Dicer結(jié)合為酶dsRNA復合物 ，隨即被切割成21～23nt的RNA片段 ，即siRNA。siRNA與 Dicer形成 RISC。siRNA 作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，并引導RISC復合體結(jié)合mRNA.隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶 Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段 ，從而可以破壞特定目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。而新產(chǎn)生的siRNA片段可再次與Dicer酶形成RISC復合體 ，介導新一輪的同源mRNA降解 ，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應 ，顯著增強了抑制基因表達的作用

2. RNA干擾技術的臨床應用與進展

2.1抗腫瘤治療

2.1.1白血病的治療 化療在惡性腫瘤的治療中具有重要地位。很多學者致力于利用RNA干擾技術治療腫瘤，以解決多重耐藥性導致化療失敗的問題。例如，w0hlbold等[2]構建了針對bcr—abl融合位點 b3a2的同源siRNA，研究結(jié)果表明特異性siRNA可以使過表達 bcr—abl蛋白的細胞系（32Dp2102wt，M07P210，CD34 十 2CML細胞 ）的bcr—abl蛋白形成組顯著下降，并且長期用這種特異性 siRNA可以逆轉(zhuǎn) bcr—abl蛋白依賴性的細胞循環(huán)調(diào)節(jié)作用而且可以選擇性地抑制細胞生長，為進一步探索慢性粒細胞白血病治療的新途徑提供了有利的實驗依據(jù)。

2.1.2治療乳腺癌 乳腺癌細胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，有研究表明利用RNA干擾技術抑制可能導致乳腺癌的基因從而達到控制乳腺癌細胞的增殖，Jiang等[3]通過構建靶向 MTA1 （ metastasis associate d-1）的短發(fā)夾RNA（ short hairpin RNA，shRNA） 并導入ER（ +） MCF-7 和 ER（ -） MDA-MB-231 乳腺癌細胞。MTA1 下調(diào)后 ER（ -） MDA-MB-231 細胞重新表達 ERα，增加了內(nèi)分泌治療的敏感性。同時降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （ matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和 cyclin D1 的蛋白表達水平，使MDA-MB-231 細胞阻滯在G0/ G1期，但對MCF-7 細胞的細胞周期無明顯影響。靶向 MTA1 沉默能明顯引起兩種乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移抑制，RNA 靶向干擾 MTA1 基因可能具有乳腺癌治療效用。 Qiu等 [4]實驗研究表明，利用 siRNA的方法靶向沉默 cripto一1基因的表達可在一定程度上抑制人乳腺癌MDA—MB468細胞的侵襲，進而抑制腫瘤的進一步發(fā)展。另外，乳腺癌50% 的首發(fā)性和 80% 的復發(fā)性轉(zhuǎn)移發(fā)生在骨骼中，Guo等提出靶向 BMP4 信號通路將成為乳腺癌治療的新手段，實驗中通過成功構建靶向BMP4的siRNA并導入MCF-7 和MBA-MD-231細胞中，抑制了癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，證明了 BMP4 在乳腺癌細胞中的作用； 同時發(fā)現(xiàn) MMP-1 和 CXCR4 的表達在 BMP4過表達的細胞中激增。

2.1.3其他腫瘤 腫瘤細胞可持續(xù)增殖，Zhou等[5]利用腺病毒介導的 RNAi轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細胞癌細胞 Hecl能抑制腺癌腫瘤的生長和增殖并使其失去致瘤性。應用慢病毒介導的RNA干擾技術將Akt1沉默，并成功轉(zhuǎn)入胃癌細胞株SGC-7901和BGC-823， 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)， Akt1沉默在體外和體內(nèi)環(huán)境下均可顯著抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。鐘英強等研究發(fā)現(xiàn)，siRNA靶向沉默 hTERT基因的表達，可在一定程度上抑制人胰腺癌 Capan-2細胞 Bcl-2、環(huán)氧化酶 2基因的表達，從而抑制腫瘤進一步惡化[6]。在前列腺癌研究領域中，金鵬等[7]已率先采用RNA干擾技術， 將針對GSTP1設計的短發(fā)卡RNA轉(zhuǎn)染人前列腺癌細胞株Du145介導GSTP1基因沉默， 發(fā)現(xiàn)能明顯抑制癌細胞增殖。

2.2抗感染

RNA技術同樣可以用于病毒、寄生蟲甚至細菌引起的感染性疾病中，尤其是對抗病毒情有獨鐘，起初是在植物中發(fā)現(xiàn) RNAi的抗病毒作用，后來在動物中也發(fā)現(xiàn)相同的作用。近幾年RNA干擾機制在抗病毒感染的研究中取得了很大進展。在病毒復制時，tat基因轉(zhuǎn)錄所必需的周期蛋白（cyclin）T1能夠顯著提高病毒基因表達水平。通過 RNAi的方法設計抑制 cyclinT1的表達 ，從而達到抑制病毒復制的目的。Deng等科學家致力于這方面的研究，最后的研究結(jié)果表明shRNA能夠阻斷乙型肝炎病毒DNA的表達與復制[8]。

2.3心腦血管疾病

2.3.心血管病 高血壓是最常見的心血管病，張敬群等[9]通過構建兩腎一夾高血壓大鼠模型用攜帶U6啟動子和血管緊張素1受體短發(fā)夾RNA編碼序列的質(zhì)粒干擾AT1a受體，結(jié)果證實可有效抑制腎血管性高血壓進展。在心肌病及心力衰竭的研究也有一定進展，李凡東等[10]通過RNA干擾IK1表達，使其電流幅度明顯下降，有利的抑制了心機細胞IK1，為治療心肌病提供了新的方法。Watanabe等[11]將肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶（SERCA2a）的RNA轉(zhuǎn)染入新生小鼠心肌細胞，通過證實SERCA2a的mRNA和蛋白水平顯著下降，而鈣離子的吸收明顯提高。楊廣等[12]也在實驗中進一步驗證了RNA可干擾心衰大鼠受磷蛋白mRNA的表達，改善心臟功能。

2.3.2腦血管病 2. 腦血管疾病致殘率、致死率極高，治療腦血管病成為了又一個研究重點。基因靶點治療主要體現(xiàn)在動脈粥樣硬化方面。脂蛋白脂肪酶（LPL）在動脈粥樣硬化中的機制不完全清楚，因此脂蛋白脂肪酶成為治療動脈硬化的突破口。劉明等[13]利用 RNAi 技術在細胞水平抑制LPL 基因的表達，結(jié)果證實抑制率可達 70%以上。這一結(jié)果為以后控制和預防腦血管疾病提供了理論依據(jù)。洪濤等[14]應用 RNAi 技術沉默平滑肌細胞間隙連接蛋白 43（ connexin43，Cx43）的表達，從而抑制了細胞間的通訊。在此基礎上，他們繼續(xù)采腺病毒介導的RNAi特異干擾腦血管痙攣 Cx43 的異常高表達，進一步證實 Cx43 及縫隙連接在腦血管痙攣發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，也為探討腦血管疾病的基因治療做出貢獻。

2.4其他

還可用于遺傳病的研究中， RNAi在基因功能和相關方面的研究中具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢 ，因此許多遺傳學家和分子生物學家對此產(chǎn)生了極大興趣，RNA干擾技術成為了遺傳學研究的新方法。實驗研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)siRNA能夠直接作用于點突變的基因使其功能喪失降低突變，野生型基因卻不受影響，因為點突變引發(fā)的遺傳性疾病能夠通過應用 RNAi技術降低突變方法進行治療。例如 ，遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病Huntington病和 Alzheimer病的治療就可以通過RNAi技術，即在腦部局部注射siRNA進行基因治療；再如應用 RNAi技術治療常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎 （adRP）的轉(zhuǎn)基因小鼠，取得了良好的效果。

3.研究進展

siRNA 的這種非特異性反應和 RNA 傳遞效率極大地影響著它的體內(nèi)應用，但進一步合理設計高效 siRNA 序列、開發(fā)在體內(nèi)具有長效功能的載體、完善更為特異性的體內(nèi)輸送途徑等將成為進一步促進 RNAi 作為疾病治療策略的研究熱點。隨著 RNAi 機理的進一步闡明，RNAi 技術將以驚人的速度向前發(fā)展，不斷取得突破，聯(lián)合多基因 RNAi 治療也將為基因治療開辟更廣闊的前景?？傊S著RNA干擾機制研究的深入和完善，應用RNA干擾技術，必將大力推動人類疾病的治療和人類功能基因組學的發(fā)展。

參考文獻

[1]Ashihara E，Kawata E，Maekawa T.Future prospect of RNA interference for cancer the rapies[J].Curr Drug Targets，2010，11（3）：345-360.

[2] Wohlbold L ，Van DerKuip H ，Miething C .et al.Inhibition of bcr—abl gene expression by small interfering RNA sensitizes for imatinib mesylate（STI571）[J].Blood，2003，102（6）：2236一2239.

[3] 邱志遠 ，范鈺 ，王崇強等.Cripto-1基因 siRNA對乳腺癌細胞侵襲力的影響[J].山東醫(yī)藥 ，2010，50（2）：27-29.

[4] GurzovEN.Izquierdo M .RNA interferenee against Hecl inhibits tumor growth invivo[J].GenehTer，2006，13（1）：1_7.

[5] Zhou W， Fu XQ， Liu J， Yu HG. RNAi knockdown of the Akt1 gene increases the chem osensitivity of gastric cancer cells to cisplatin both in vitro and invivo[J]. Regul Pept 2012； 176： 13-21.

[6] 鐘英強，黃花榮，付玉如等.siRNA 靶向沉默 hTERT 基因?qū)θ艘认侔┑牡蛲鲆种苹?bcl-2 和環(huán)氧合酶-2基因表達的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2010，4（8）：1221—1225.

[7] 金鵬， 謝晉良， 朱向榮等. shRNA介導GSTP1基因沉默對激素非依賴性前列腺癌細胞株DU145的影響[J]. 中南大學學報（醫(yī)學版） 2012； 37：807-816.

[8] DengL，LiG ，XiL，et al.Hepatitis B virus inhibition in mice by lentivirla vector mediated short hairpin RNA[J].BMC Gastroenterol，2009 Oct 6； 9：73.

[9] 張敬群， 孫紅蕾， 馬業(yè)新，等. RNA干擾血管緊張素Ⅱ1a型受體對腎血管性高血壓大鼠血壓及心肌肥厚的影響[J].中華醫(yī)學雜志，2006，86（16）：1-6.

[10] 李凡東，張海州，鄒承偉，等. 核糖核酸干擾抑制心肌細胞KCNJ2基因表達[J]. 中國循環(huán)雜志，2005，20（ 6） ： 468-471.

[11] Watanabe A，Arai M，Yamazaki M，et al. Phospholamban ablation by RNA interference increase Ca2 + up take into rat cardiac myocytesarcoplasmic reticulum[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，37 （ 3 ） ：691-698.

[12] 楊廣，李小鷹，魯曉春. 利用 RNA 干擾技術治療慢性心衰大鼠的研究[J]. 中國分子心臟病學雜志，2007，7（ 2） ： 99-103.

[13] 劉明，趙鐵強，冼勛德，等. 應用 RNA 干擾技術體外抑制脂蛋白脂肪酶基因的表達[J]. 中國動脈硬化雜志，2005，13（ 1） ：45-47.

[14] 洪濤，馮九庚，蔣麗萍，等. RNA 干擾抑制血管平滑肌細胞縫隙連接 Cx43 介導的細胞間通訊[J]. 中華實驗外科雜志，2006，23（ 6） ： 768.