斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）卵巢組織石蠟切片自發(fā)熒光的研究

郭松 趙超 傅明駿 江世貴 楊其彬 邱麗華

摘要 ?[目的]利用卵巢組織石蠟切片自發(fā)熒光觀察斑節(jié)對蝦卵母細胞發(fā)育。[方法] 研究采用普通石蠟切片技術獲得斑節(jié)對蝦發(fā)育各期卵巢組織切片，采用蘇木青/伊紅染色后利用3種自發(fā)熒光對卵巢組織切片進行觀察，探討綠色自發(fā)熒光下觀察卵母細胞不同發(fā)育階段需要的最適曝光時間。[結果] 卵巢組織切片直接自發(fā)熒光觀察卵母細胞的發(fā)育較HE染色后觀察更為方便、有效，且切片可以繼續(xù)用于后續(xù)試驗。3種自發(fā)熒光中，綠色自發(fā)熒光的觀察效果最好。[結論] ?該研究可為快速觀察斑節(jié)對蝦卵母細胞發(fā)育和高效利用試驗材料提供了新思路和新方法。

關鍵詞 斑節(jié)對蝦;卵母細胞發(fā)育;組織切片;自發(fā)熒光

中圖分類號 S945.4+7 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-136-06

Study on the Autofluorescence of Paraffin Section of Penaeus monodon

GUO Song¹， 2， ZHAO Chao¹， 3， FU Mingjun¹， 3， QIU Lihua¹， 3* et al

（1. South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou， Guangdong 510300; 2. College of Aqua-life Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization， Ministry of Agriculture， Guangzhou， Guangdong 510300）

Abstract ? ? [Objective] The ovarian development of Penaeus monodon was observed by using auto-fluorescence of oocyte paraffin section. [Method] The paraffin section of ovary in P. monodon indifferent development stages by using common paraffin section technology. The ovary sections were observed by using three kinds of auto-fluorescences after hematoxylin and eosin dyeing. The optimum exposure time for different development stages of oocytes under green auto-fluorescence was discussed. [Result] It was more convenient and effective to observe the development of oocyte by using auto-fluorescence of ovary sections than that by HE dyeing. And the sections could be used in further experiments. Among three kinds of auto-fluorescence， the observation effects by using green auto-fluorescence was the best. [Conclusion]The research could provide new thought and method for the rapidly observing the development of P. monodon oocytes and effectively utilizing the test materials.

Key words ? Penaeus monodon; Oocyte development; Tissue sections; Auto-fluorescence

基金項目 國家自然科學基金項目（31101903）;廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項（A201300B03）;廣東省科技計劃項目（2013B04 0402016）;海南省應用技術研發(fā)與示范推廣專項（ZDXM2014057）;海南省自然科學基金（313117）。

作者簡介 郭松（1987- ），男，河南淮濱人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究。

收稿日期 20141119

斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）作為世界三大對蝦養(yǎng)殖品種之一^[1-3]，在國內(nèi)外都有著大量研究報道。斑節(jié)對蝦的全人工繁育技術已經(jīng)成功，但斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子機理仍然不十分清楚。近年來，已有多個斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育相關的基因被研究^[4-7]，組織切片觀察是目前常用的鑒定卵母細胞發(fā)育的方法，以卵巢組織切片為基礎的免疫組化、原位雜交等技術廣泛應用于在研究卵巢發(fā)育相關因子在卵母細胞中的定位等研究中。目前采用的蘇木青/伊紅染色后觀察操作繁瑣且不利于切片的再利用，因此能夠不通過染色直接通過切片鑒定卵巢組織切片卵母細胞的發(fā)育成為十分實用的方法。筆者首次在斑節(jié)對蝦中報道卵巢組織切片自發(fā)光及其應用，采用普通石蠟切片技術獲得斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育各期卵巢組織切片，采用HE染色和卵巢組織切片自發(fā)熒光對切片進行了觀察，并比較了各自的優(yōu)缺點;利用3種熒光對觀察卵巢組織切片，比較3種熒光的觀察效果，并對綠色自發(fā)熒光最適曝光時間進行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

斑節(jié)對蝦來源于海南省三亞市野生捕撈，體重80～200 g，水溫（25±1）℃、鹽度為30‰的循環(huán)水池中暫養(yǎng)7 d。取發(fā)育至各期的卵巢中葉部分用Bouin氏液固定。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織切片。

用Bouin氏液固定樣品24 h以上，流水浸泡2 h去除固定液，參照用 Bell方法 ^[8] 進行染色、切片和組織學觀察。脫水使用Leica4-2429自動脫水機完成，LeicaEG1160組織包埋機進行石蠟包埋，Leica轉輪式切片機切片，切片厚度設定為4 μm，使用LeicaAUTOSTAINER·XL染色機進行常規(guī)HE染色。

1.2.2 顯微鏡觀察。

HE染色切片在ZEISS光學顯微鏡下觀察并于適當倍數(shù)下拍照。未經(jīng)任何處理的石蠟切片在AMG EVOS f1（LIFE，USA）熒光顯微鏡下觀察并于適當倍數(shù)下拍照。3種熒光均是在60%光強、曝光250 ms下拍照;綠色自發(fā)熒光在不同曝光時間下觀察卵母細胞發(fā)育不同狀態(tài)，采用的是100%光強比較不同曝光時間下的拍照效果;熒光照片采用60%光強，曝光250 ms。

2 結果與分析

2.1 3種熒光觀察效果的比較 從圖1 可以看出，核仁期細胞和周邊核仁期細胞在3種波段光的激發(fā)下呈現(xiàn)較為均勻的顏色，細胞核呈現(xiàn)黑色。卵黃囊卵母細胞和早期以及晚期的皮質棒期，綠色自發(fā)熒光能夠較好地展示顆粒狀的物質。皮質棒狀體在3種自發(fā)熒光下呈現(xiàn)為黑色。在相同的曝光時間和光強下，3種顏色的自發(fā)熒光都可用于卵巢組織切片卵母細胞發(fā)育的觀察。3種顏色的自發(fā)熒光中，綠色自發(fā)熒光在清晰度和觀察范圍上比紅色和藍色自發(fā)熒光好。

注：CN.染色質核仁期卵母細胞;PO.周邊核仁期卵母細胞;YO.卵黃囊卵母細胞;CR.皮質桿狀細胞。

圖1 卵巢組織切片在3種熒光下自發(fā)熒光效果的比較

2.2 綠色熒光不同曝光時間下觀察發(fā)育至各個時期的卵母細胞

從圖2可以看出，在曝光時間為250 ms時觀察效果最好，500 ms時出現(xiàn)曝光過度;從圖3可以看出，在綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細胞需要曝光250 ms;從圖4～5可以看出，在皮質棒期的卵母細胞，只需要60 ms曝光即可得到較好的觀察效果。在60 ms曝光時間下，卵母細胞發(fā)育的不同形態(tài)均可以得到較為清晰的觀察。

2.3 綠色熒光自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色的效果比較

從圖6可以看出，利用組織自發(fā)綠色自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色相比能夠更好地觀察卵母細胞中的顆粒，且色彩鮮艷美觀。在發(fā)育早期的卵母細胞中，常規(guī)HE染色觀察結果背景較深;在卵黃囊卵母細胞期自發(fā)綠色自發(fā)熒光較好地展現(xiàn)了細胞質中的顆粒狀物質及其分布的位置;在早期和晚期的皮質棒卵母細胞中，2種方法都能夠很好地展示細胞中的皮質棒結

注：A.曝光時間15 ms;B.曝光時間30 ms;C.曝光時間60 ms;D.曝光時間120 ms;E.曝光時間250 ms;F.曝光時間500 ms。

圖2 綠色自發(fā)熒光下觀察核仁期細胞和周邊核仁期細胞（20×）

注：A.曝光時間15 ms;B.曝光時間30 ms;C.曝光時間60 ms;D.曝光時間120 ms;E.曝光時間250 ms;F.曝光時間500 ms。

圖3 綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細胞（10×）

注：A.曝光時間15 ms;B.曝光時間30 ms;C.曝光時間60 ms;D.曝光時間120 ms;E.曝光時間250 ms;F.曝光時間500 ms。

圖4 綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細胞早期皮質棒期卵母細胞（10×）

注：A.曝光時間15 ms;B.曝光時間30 ms;C.曝光時間60 ms;D.曝光時間120 ms;E.曝光時間250 ms;F.曝光時間500 ms。

圖5 綠色自發(fā)熒光下觀察晚期皮質棒期卵母細胞（10×）

安徽農(nóng)業(yè)科學 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

構，但在皮質棒間隙中的顆粒狀物質的展示上，組織自發(fā)綠色熒光的觀察效果優(yōu)于常規(guī)HE染色。

3 討論

海洋生物或者其組織能夠激發(fā)后發(fā)出熒光是較為普遍的現(xiàn)象，如目前廣泛應用的綠色熒光蛋白（GFP）^[9-12]。與生物發(fā)光現(xiàn)象不同，自發(fā)熒光一般需要熒光蛋白被一定范圍波長的激光激發(fā)。熒光蛋白主要應用在與抗體、生物素、免疫蛋白等物質結合作為熒光探針，通過激發(fā)發(fā)出的熒光對相關物質的分布等進行研究。斑節(jié)對蝦卵巢組織石蠟切片能夠自發(fā)熒光的現(xiàn)象對于研究斑節(jié)對蝦卵母細胞的發(fā)育具有重要意義。

該試驗中使用的熒光顯微鏡3種熒光模塊（DAPI、GFP、RFP）分別能夠產(chǎn)生360、470和530 nm的激發(fā)光，分別激發(fā)產(chǎn)生447 nm的藍色熒光、525 nm的綠色熒光和593 nm的紅色熒光。3種激發(fā)光分別屬于熒光顯微鏡常用激發(fā)片組：360 nm的激發(fā)光屬于紫外光范圍（330～400），470 nm屬于藍色片組（420～485），530 nm屬于綠色激發(fā)片組（460～550）。斑節(jié)對蝦卵巢組織石蠟切片能夠被3種激發(fā)光激發(fā)，可能是因為自發(fā)熒光的物質的激發(fā)波長范圍較廣，根據(jù)該試驗結果可

注：A～D：自發(fā)光;E～H：常規(guī)HE染色。

圖6 綠色熒光組織自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色的效果比較（10×）