煙草抗馬鈴薯Y病毒（PVY）病突變體篩選與鑒定

喬嬋 萬(wàn)秀清 李若 魏亭宇 吳國(guó)順 都興洋 黃磊

摘要

[目的]篩選與鑒定煙草抗PVY病突變體，為尋找抗PVY的基因奠定基礎(chǔ)。[方法]通過苗期對(duì)煙草突變材料進(jìn)行PVY接種鑒定，肉眼對(duì)材料進(jìn)行初步篩選，對(duì)篩選到的抗性材料進(jìn)一步熒光定量鑒定，對(duì)篩選鑒定的抗性材料進(jìn)行苗期鑒定及田間抗性鑒定。[結(jié)果]2011年篩選獲得2個(gè)高抗PVY的突變體MZE215和MZE216，以及3個(gè)耐PVY突變體MZE270、MZE2207及MZE2228;2012年進(jìn)一步篩選鑒定，突變體材料MZE2407和MZE2428感PVY，MZE216和2份MZE215突變體材料抗PVY。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為控制煙草PVY病的危害提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 煙草;PVY;突變體

中圖分類號(hào) S572 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2015）03-099-03

Selection and Identification of Tobacco Mutants with PVY Resistance

QIAO Chan， WAN Xiuqing*， LI Ruo et al

（Mudanjiang Tobacco Research Institute，Mudanjiang， Heilongjiang 157011）

Abstract [Objective] Tobacco mutants with PVY resistance were selected and identified to lay the basis for finding PVY resistant genes. [Method] Different tobacco mutants were inoculated with PVY in seedling stage and were preliminarily selected by nakedeye observation. Enzymelinked immunosorbent assay （ELISA）， realtime fluorescence quantitative PCR and test strip assay were performed to further identify preselected mutants. Finally， resistance of these identified mutants was evaluated by pot culturing in green house and in the open field. [Result] Two mutants MZE215 and MZE216 showing high PVY resistance and three mutants MZE270， MZE2207and MZE2228 with tolerant PVY resistance were obtained in 2011. These mutants were further identified in 2012， and results showed that MZE2407 and MZE2428 were PVY susceptible， whereas MZE216 and MZE215 were PVY resistant. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the control of tobacco PVY.

Key words ?Tobacco; PVY; Mutants

基金項(xiàng)目 國(guó)家局煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)突變體項(xiàng)目[110201201004（JY04）]。

作者簡(jiǎn)介

喬嬋（1978-），女，黑龍江雙城人，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草分子生物學(xué)和病理學(xué)研究。*通訊作者，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，從事煙草分子生物學(xué)和病理學(xué)研究。

收稿日期 20141203

煙草PVY病又稱為葉脈壞死病、煙草脈帯病、黃斑病，是能系統(tǒng)侵染煙草的病害^[1-2]。煙草PVY病在我國(guó)分布廣，危害重，對(duì)煙草生產(chǎn)的危害正逐年加重，近年來更是在多個(gè)煙區(qū)呈急劇上升趨勢(shì)，已成為危害我國(guó)各煙區(qū)煙草的主要病毒病害之一^[3-4]。煙草一旦感染PVY，整片葉子幾乎失去烘烤價(jià)值，嚴(yán)重情況下煙莖壞死、葉片壞死，每公頃產(chǎn)值減少11%～18%;除影響產(chǎn)量外，被PVY侵染后的煙葉全氮含量增加，煙堿含量升高，尼古丁含量增加，糖氮比降低，還原糖減少，烤曬后的色澤及氣味等品質(zhì)均大大降低，煙葉等級(jí)指數(shù)也降低36%～62%^[5-6];PVY侵染煙草引起的PVY病嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展^[7]。

煙草基因組重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草突變體庫(kù)創(chuàng)制、篩選與分析”實(shí)施以來，通過化學(xué)和生物學(xué)方法創(chuàng)制和收獲了15萬(wàn)份煙草突變二代種子，建立了10個(gè)表型篩選方法和2個(gè)序列篩選方法^[8]。筆者以此為基礎(chǔ)，開展了煙草抗PVY病突變體篩選與鑒定，旨在為控制煙草PVY病的危害提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

230份中煙100的EMS突變材料（山東省青州煙草研究院提供），PVY抗性對(duì)照品種VAM，PVY感病對(duì)照品種NC95。LJ925（抗TMV，感PVY）接種毒源。PVY檢測(cè)試紙條及PVY株系檢測(cè)試劑盒;分子生物學(xué)試驗(yàn)試劑材料。

1.2 方法

1.2.1

PVY毒源的采集、鑒定及繁殖。

1.2.1.1

毒源的采集。從黑龍江省哈爾濱煙葉產(chǎn)區(qū)和牡丹江煙葉產(chǎn)區(qū)采集疑似PVY樣品，置于冰箱冷凍保存。

1.2.1.2

毒源的分子鑒定。通過從Genbank上下載的PVY各株系序列的比對(duì)，設(shè)計(jì)合成PVY通用鑒定引物，引物設(shè)計(jì)于P1基因，PCR擴(kuò)增片段為730 bp左右; 10.0 μl的PCR擴(kuò)增體系為：2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μl， 10× PCR buffer 1.0 μl， Taq酶0.2 μl，引物各0.5 μl，超純水5.8 μl，菌液模板1.0 μl。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min; 94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.2 min，循環(huán)36次;72 ℃延伸10 min。引物序列：PVYF，5TGC/TTA/TCCA/GTACTCACCC/AGC3;PVYR，5′CCACG/ACACTATGAAT/CAA/GGCC3′。利用該引物對(duì)保存的毒源進(jìn)行鑒定，對(duì)特異條帶進(jìn)行回收測(cè)序。

1.2.1.3

PVY毒源的繁殖。將通過生物學(xué)鑒定方法分離出純的PVY病毒煙葉剪成碎片研成汁液，加入汁液體積10倍的PBS緩沖液（pH 7.27）。在烤煙品種LJ925煙草團(tuán)棵期，選取中上部2片葉子進(jìn)行病毒摩擦接種，接種20 d左右表現(xiàn)明顯的PVY癥狀。

1.2.2

突變體煙苗種植方法。

2011年4月8日播種230份突變體材料種子、感PVY的煙草品種NC95和抗PVY的煙草品種VAM作為對(duì)照品種，2011年5月4日假植，每份材料假植20株，NC95和VAM各假植2盤。

1.2.3

苗期PVY接種鑒定方法。在煙苗4片真葉時(shí)期（2011年5月23日），采用毛刷蘸取新鮮PVY汁液進(jìn)行接種，接種后20 d煙苗顯癥，以抗病品種VAM外觀形態(tài)及感病品種NC95 PVY癥狀為對(duì)照，拔除感病的煙苗（2011年6月15日），剩余未顯癥煙苗噴肥后繼續(xù)觀察，7～10 d后第2次將感病煙苗拔除（2011年6月26日）。剩余沒有明顯PVY癥狀的煙苗成苗后移栽至大田進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.2.4

大田期PVY接種鑒定方法。經(jīng)苗期篩選后移栽至大田的煙苗，生長(zhǎng)至團(tuán)棵期后接種PVY病毒，接種方法同“1.2.3”。接種后20～30 d以抗病品種VAM外觀形態(tài)及感病品種NC95 PVY癥狀為對(duì)照，調(diào)查各材料發(fā)病情況，現(xiàn)蕾期對(duì)沒有明顯PVY癥狀的煙苗套袋留種。

1.2.5

PVY抗性材料抗性遺傳穩(wěn)定性鑒定方法。

對(duì)2011年最終篩選出的5份無PVY癥狀及癥狀不明顯的突變體材料在2012年進(jìn)行進(jìn)一步的篩選鑒定。2012年3月30日對(duì)5份材料進(jìn)行播種，2012年4月19日假植，每個(gè)材料假植1盤。2012年5月14日利用繁殖的PVY毒源第1次進(jìn)行苗

期PVY接種，2012年5月27日第2次進(jìn)行苗期PVY接種，

2012年6月18日進(jìn)行移栽，每個(gè)材料選擇無明顯PVY癥狀的煙苗移栽24株，田間正常農(nóng)業(yè)管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY毒源的采集樣品、分子鑒定及繁殖樣品

2.1.1

PVY毒源的采集樣品。采集的毒源樣品見圖1。

圖1 采集的毒源樣品

2.1.2

PVY毒源的分子鑒定。毒源測(cè)序比對(duì)結(jié)果如下：

利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)繁殖的PVY毒源及其他保存的毒源進(jìn)行了鑒定，對(duì)特異條帶進(jìn)行了回收測(cè)序。由表1可知，該毒源與PVY NE11分離物具有99%的同源性，證實(shí)為PVY病毒。

2.1.3

PVY毒源的繁殖樣品。PVY突變體繁殖的毒源見圖2。

2.2 PVY突變體材料苗期及大田期篩選鑒定

2.2.1

PVY突變體材料苗期篩選。

230份突變體材料，其中有3份材料未發(fā)芽，其他材料生長(zhǎng)良好（圖3～6）。苗期經(jīng)過觀察篩選，最終篩選出314株突變體材料進(jìn)行田間種植。

2.2.2

PVY突變體材料大田期篩選鑒定。

將苗期篩選出的煙苗進(jìn)行田間種植，在團(tuán)棵期進(jìn)行了PVY癥狀調(diào)查，篩選出16株無PVY癥狀或癥狀不明顯的煙苗，對(duì)其重新進(jìn)行PVY接種，8月末再次進(jìn)行PVY調(diào)查，最終篩選出5份無PVY癥狀及癥狀不明顯的煙苗，其中2份基本看不到任何PVY癥狀，另外3份癥狀較輕（圖7～9）。其中，MZE216、MZE215達(dá)到高抗，MZE270及MZE2407達(dá)到中抗水平，MZE2428為中感。利用RTPCR方法對(duì)上述幾份材料進(jìn)行PVY病毒檢測(cè)，結(jié)果表明各樣品均感染PVY病毒，只是程度有所不同。

2.2.3

大田期PVY抗性穩(wěn)定性鑒定結(jié)果。

2012年7月23日進(jìn)行田間PVY抗性調(diào)查。由表2可知，5份突變體材料都移栽了24棵，其中MZE2428存活的棵數(shù)最少，為14棵，MZE216存活的棵數(shù)最多，為21棵;從抗病性來看，突變體材料MZE2407（圖10）和MZE2428出現(xiàn)了感PVY的癥狀，MZE216和2份MZE215（圖11）突變體材料對(duì)PVY病毒具有抗性。因?yàn)樵摯卧囼?yàn)的PVY株系致病性較強(qiáng)，導(dǎo)致煙苗死亡的發(fā)生。

3 討論

煙草感染PVY后，因品種和病毒株系的不同所表現(xiàn)的

病狀特點(diǎn)亦有明顯差異，所以對(duì)于PVY毒源的選擇也很重要，要選擇點(diǎn)刻條斑癥的毒源，該種毒源發(fā)病初期病葉先形成褪綠斑點(diǎn)，之后葉肉變成紅褐色的壞死或條紋斑，葉片呈青銅色。是PVY區(qū)別于其他病害獨(dú)有的癥狀，利于接種后煙株的觀察和選擇，以防誤判，影響最終突變體的篩選。

煙草苗期（4葉期）接種PVY后，癥狀一般在15 d左右顯現(xiàn)，癥狀是否明顯與煙苗的營(yíng)養(yǎng)狀況有直接關(guān)系，煙苗萎

蔫、弱小、黃化等均不利于癥狀觀察，因此需要加強(qiáng)苗期管理，保證煙苗不脫水、脫肥（10 d左右噴施一次煙草葉面肥），但過量的水肥會(huì)造成煙苗根部滋生真菌，需要密切注意。一般可考慮10 d左右噴施一次煙草葉面肥。另外，要防止煙苗發(fā)生其他病害（野火病、炭疽病、TMV等），這些病害也會(huì)給PVY癥狀鑒定帶來影響。

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