藥用植物毛狀根技術(shù)的研究

李文龍 王媛媛 張芳芳 劉淑靜 劉宇 張東吉 張躍華

摘要 闡述了發(fā)根農(nóng)桿菌的作用機(jī)理，對(duì)毛狀根誘導(dǎo)過(guò)程中外植體、發(fā)根農(nóng)桿菌種類、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間、外源激素添加、酚類物質(zhì)添加及培養(yǎng)條件等因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行系統(tǒng)的論述，并對(duì)藥用植物毛狀根的鑒定方法及在次生代謝物的合成機(jī)制研究及生產(chǎn)、藥用植物基因工程、新藥物的產(chǎn)生、藥物蛋白生產(chǎn)等方面的應(yīng)用進(jìn)行概述。

關(guān)鍵詞 藥用植物;發(fā)根農(nóng)桿菌;毛狀根

中圖分類號(hào) S567 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2015）03-044-03

Study on Hairy Roots of Medicinal Plant Technology

LI Wenlong¹， WANG Yuanyuan¹， ZHANG Fangfang¹， ZHANG Yuehua2* et al

（1. College of Life Sciences of Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007; 2. Faculty of Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract This paper describes the action mechanism of Agrobacterium rhizogene，effects of explants， Agrobacterium rhizogene species， preculture and coculture time， exogenous hormones， polyphenols and culture conditions on the induction rate during hairy roots induction process were elaborated. The identification method of medicinal plants hairy roots， and the application in synthesis mechanism and production of secondary metabolites， the medicinal plant gene engineering， development of new drugs， pharmaceutical protein production were reviewed.

Key words Medicinal plants; Agrobacterium rhizogenes; Hairy roots

基金項(xiàng)目 佳木斯大學(xué)校長(zhǎng)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目（xzyf201308）。

作者簡(jiǎn)介 李文龍（1990- ），男，山東曹縣人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者。

收稿日期 20141205

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種土壤細(xì)菌，具有廣泛侵染性，能夠誘導(dǎo)植物形成毛狀根，Hildebrand于1934年在對(duì)蘋果樹的研究中闡述了該現(xiàn)象^[1]。發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒侵染植物后，雙子葉植物大多數(shù)能夠誘導(dǎo)出毛狀根，而單子葉植物只有少數(shù)能夠在感染部位長(zhǎng)出毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有次生代謝物高且可以穩(wěn)定存在，還具有生長(zhǎng)速度快和易獲得再生植株等優(yōu)點(diǎn)。毛狀根技術(shù)被應(yīng)用于藥用植物的研究，成為藥用植物研究的一個(gè)新方向。

1 發(fā)根農(nóng)桿菌作用機(jī)理

發(fā)根農(nóng)桿菌上含有一個(gè)巨大的侵入質(zhì)?！猂i質(zhì)粒，大小為200～800 kb，其上含有2個(gè)與轉(zhuǎn)化有關(guān)的區(qū)域：Vir區(qū)（致病區(qū)）和TDNA區(qū)（轉(zhuǎn)移區(qū)）。發(fā)根農(nóng)桿菌作用于藥用植物，感染后可在傷口部位誘導(dǎo)出毛狀根就是由發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的TDNA區(qū)和Vir區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在自然狀態(tài)下，發(fā)根農(nóng)桿菌上的Ri 質(zhì)粒作為基因載體可以直接作用于藥用植物傷口處細(xì)胞;在藥用植物傷口組織處會(huì)產(chǎn)生乙酰丁香酮等酚類化合物及多糖物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)Ri質(zhì)粒內(nèi)vir基因表達(dá);vir基因表達(dá)產(chǎn)物再作用于TDNA區(qū)，使TDNA區(qū)的DNA片段能插入整合到藥用植物的基因組，DNA片段整合到宿主細(xì)胞后表達(dá)，促使傷口處組織分化產(chǎn)生大量毛狀根^[2]。

2 藥用植物毛狀根誘導(dǎo)及鑒定

藥用植物毛狀根誘導(dǎo)常用的方法有3種，即直接接種法、外植體共培養(yǎng)法、原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。直接接種法：利用藥用植物種子獲得無(wú)菌苗，在莖上劃出傷口，將活化好的農(nóng)桿菌接種到傷口上，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后就會(huì)從傷口處長(zhǎng)出毛狀根，此種方法最為簡(jiǎn)單便捷。外植體共培養(yǎng)法：取藥用植物的葉片、葉柄或莖段等無(wú)菌外植體與活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)2～3 d后，在加有抗生素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，除掉發(fā)根農(nóng)桿菌，一段時(shí)間后在外植體切口處長(zhǎng)出毛狀根。原生質(zhì)體共培養(yǎng)法：獲得藥用植物原生質(zhì)體，與活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后在加有抗生素的培養(yǎng)基上篩選，最后在分化培養(yǎng)基上獲得完整毛狀根或植株，該方法對(duì)原生質(zhì)體要求高且篩選和除菌較麻煩。

誘導(dǎo)出的藥用植物毛狀根大多具有分支多、大量白色根毛、失去向地性生長(zhǎng)、液體培養(yǎng)速度快于正常根的特點(diǎn)，因此，可以根據(jù)毛狀根的特性從形態(tài)學(xué)水平上對(duì)毛狀根進(jìn)行鑒定。藥用植物被感染細(xì)胞將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA整合后，在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成特異的冠癭堿，利用硝酸銀試劑或磷鉬酸試劑染色法和高壓紙電泳法^[3-6]檢測(cè)藥用植物毛狀根中是否含有冠癭堿，從細(xì)胞水平上判斷是否轉(zhuǎn)化成功。此外，還可以利用PCR擴(kuò)增技術(shù)從分子水平上對(duì)誘導(dǎo)出的毛狀根進(jìn)行鑒定。

3 影響毛狀根誘導(dǎo)的因素

3.1 外植體

在藥用植物毛狀根誘導(dǎo)時(shí)，外植體的選取十分關(guān)鍵。同一種發(fā)根農(nóng)桿菌感染，不同藥用植物同一外植體或同種藥用植物的不同外植體及同一藥用植株的不同發(fā)育階段的外植體轉(zhuǎn)化率都存在顯著差異。同一種發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)同屬植物不同植株的同一外植體進(jìn)行感染，轉(zhuǎn)化效率由于植株種類存在明顯差異。劉傳飛等^[7]在發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)同屬植物作用的研究中，用R1601菌株同時(shí)感染3種葛屬植物，發(fā)現(xiàn)三裂葉葛、野葛和山葛葉片毛狀根的誘導(dǎo)率分別為28%、15%和17%。同一種發(fā)根農(nóng)桿菌感染同種藥用植株時(shí)，一般葉片的轉(zhuǎn)化率會(huì)高于莖和葉柄，幼嫩植物組織器官的轉(zhuǎn)換率會(huì)高于發(fā)育成熟的植物組織器官。王莉等^[8]在何首烏毛狀根培養(yǎng)的研究中，利用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402對(duì)何首烏葉、葉柄和莖切段分別進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉柄和莖的誘導(dǎo)率分別為66.7%和46.7%，而葉的誘導(dǎo)率高達(dá)100%。胡忠等^[9]在枸杞發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系建立的研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞的毛狀根誘導(dǎo)頻率與外植體的發(fā)育年齡和生理狀態(tài)密切相關(guān)。

3.2 菌株種類

不同菌種的發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)于同種藥用植物轉(zhuǎn)化率不同。劉峻等^[10]在人參Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立的研究中，分別使用發(fā)根農(nóng)桿菌15834、LBA918、A4、R1000、1601感染人參外植體，結(jié)果有15834菌株可誘導(dǎo)出人參毛狀根，證明不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)同一藥用植株致根能力不同。一般發(fā)根農(nóng)桿菌中的堿型菌比甘露堿型菌株具有更廣泛的寄主范圍，如LBA9402、A4、1601、8196、15834等常用的堿型菌。Hamill等^[11]利用發(fā)根農(nóng)桿菌堿型菌株LBA9402進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙子葉植物大多都能誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。

3.3 預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間

藥用植物外植體在感染發(fā)根農(nóng)桿菌之前，接種到空白培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一定時(shí)間，可以提高轉(zhuǎn)化率并解決外植體傷口處細(xì)胞因過(guò)敏反應(yīng)導(dǎo)致的褐化問題。因?yàn)樵陬A(yù)培養(yǎng)過(guò)程中，外植體傷口能夠形成乙酰丁香酮等物質(zhì)并釋放出誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌識(shí)別的信號(hào)分子。TDNA由發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移并整合到受感染細(xì)胞DNA上需要一定的時(shí)間，所以，外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到毛狀根的誘導(dǎo)率。在誘導(dǎo)藥用植物毛狀根時(shí)，要適當(dāng)延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間，以提高轉(zhuǎn)化頻率。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，Ri質(zhì)粒上的T-DNA還不能完成轉(zhuǎn)移與整合，則無(wú)法得到轉(zhuǎn)化的毛狀根;共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)根農(nóng)桿菌增長(zhǎng)過(guò)量易導(dǎo)致植物組織死亡。孫敏等^[12]在長(zhǎng)春花轉(zhuǎn)化毛狀根誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)2 d時(shí)轉(zhuǎn)化頻率最高達(dá)到44.44%，當(dāng)共培養(yǎng)2 d時(shí)轉(zhuǎn)化頻率最高達(dá)到50.70%。

3.4 外源激素

藥用植物毛狀根誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入一定量的外源激素，會(huì)使外植體傷口處細(xì)胞對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌比較敏感，從而提高轉(zhuǎn)化頻率。劉峻等^[10]在人參毛狀根系轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，外植體在含NAA 3×10-6 mg/L、KT 0.3×10-6 mg/L的培養(yǎng)基中愈傷化程度最高，轉(zhuǎn)化頻率也最高，達(dá)到58%。王沖之等^[13] 在Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化西洋參的研究中發(fā)現(xiàn)，西洋參外植體在添加2，4D 1 mg/L、KT 0.1 mg/L的MS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，難以誘導(dǎo)出毛狀根，而在添加NAA 6 mg/L的MS瓊脂培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出毛狀根。

3.5 酚類物質(zhì)

毛狀根誘導(dǎo)發(fā)生過(guò)程中，植物外植體的傷口處會(huì)分泌某些酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)能夠引起Vir區(qū)基因的活化，從而提高毛狀根的轉(zhuǎn)化頻率。因而，可以人為地在誘導(dǎo)過(guò)程中加入促進(jìn)轉(zhuǎn)化的酚類物質(zhì)來(lái)提高轉(zhuǎn)化頻率。目前廣泛使用的酚類物質(zhì)有乙酰丁香酮、香草酚、羥基乙酰丁香酮等。添加適量的乙酰丁香酮可以提高轉(zhuǎn)化頻率，但對(duì)有些藥用植物誘導(dǎo)不僅無(wú)效且會(huì)有毒害作用。劉峻等^[10]在進(jìn)行人參轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，植株幼莖經(jīng)1×10-4 mol/L的乙酰丁香酮處理后，轉(zhuǎn)化頻率明顯提高。

3.6 培養(yǎng)條件

在毛狀根誘導(dǎo)過(guò)程中，溫度和光照也是重要的外界影響因素。發(fā)根農(nóng)桿菌的增殖和活力對(duì)外界溫度變化十分敏感。25～30 ℃發(fā)根農(nóng)桿菌的增長(zhǎng)最快，在28 ℃時(shí)，vir基因表達(dá)能力最強(qiáng)，適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度，可以提高轉(zhuǎn)化頻率。毛狀根誘導(dǎo)過(guò)程中光照時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響誘導(dǎo)率，大多數(shù)植物毛狀根的誘導(dǎo)在黑暗條件下進(jìn)行，而黃遵錫等^[14]研究發(fā)現(xiàn)紫苑毛狀根在12 h/d光照條件下的誘導(dǎo)頻率比黑暗條件下高，在全天24 h光照條件下短葉紅豆杉毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳。

3.7 其他因素

藥用植物毛狀根誘導(dǎo)頻率除以上幾種因素外，還受到其他因素的影響。MS、LS等高鹽培養(yǎng)基有助于毛狀根的形成;培養(yǎng)基中糖類物質(zhì)的含量會(huì)影響毛狀根的誘導(dǎo)率;超聲波和真空滲透處理藥用植物材料能增加農(nóng)桿菌與藥用植物外植體之間的接觸面積，提高轉(zhuǎn)化頻率;適當(dāng)?shù)木N濃度也會(huì)提高轉(zhuǎn)化頻率，發(fā)根農(nóng)桿菌菌種濃度在660 nm下的吸光度為0.5～0.8時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率顯著提高;共培養(yǎng)后除菌時(shí)抗生素種類和濃度的不同對(duì)轉(zhuǎn)化頻率有一定的影響;培養(yǎng)基的pH及NH₄NO₃含量對(duì)毛狀根的轉(zhuǎn)化頻率也有一定的影響。

4 藥用植物毛狀根的應(yīng)用

20世紀(jì)80年代毛狀根技術(shù)出現(xiàn)后受到高度重視，90年代起，藥用植物毛狀根的研究開始趨熱。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，成功誘導(dǎo)出毛狀根的藥用植物已有近百余種，其中76%為草本植物，7%為藤本植物，其余17%為木本植物。近十幾年來(lái)，人們不僅從人參、丹參、甘草、青蒿等數(shù)十種藥用植物中誘導(dǎo)出毛狀根，而且對(duì)培養(yǎng)條件、基因?qū)霗C(jī)理及有效藥用成分含量進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。藥用植物起藥效作用的一般都是其次生代謝產(chǎn)物，藥用植物的毛狀根具有次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定、生長(zhǎng)快的特點(diǎn)，且毛狀根可以產(chǎn)生生物堿、蔡醒、皂普、蔥釀、多糖類、蛋白等代謝產(chǎn)物。藥用植物毛狀根主要應(yīng)用在次生代謝物的合成機(jī)制研究及生產(chǎn)、藥用植物基因工程、新藥物的產(chǎn)生及藥物蛋白生產(chǎn)。