神經(jīng)生長因子在大鼠彌漫性軸索損傷后對NgR蛋白表達(dá)的影響

李威 楊立堅(jiān) 譚龍等

【摘要】目的：研究神經(jīng)生長因子（NGF）對大鼠自由落體腦損傷后腦內(nèi)NgR蛋白表達(dá)的影響。方法：將80只S-D雄性大鼠隨機(jī)分為4組：即正常對照組，假手術(shù)組，腦損傷（DAI）模型組，DAI后NGF治療組。復(fù)制大鼠自由落體腦損傷模型，在外傷后1d、3d、7d、14d，利用免疫組化染色檢測神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NgR蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：腦內(nèi)NgR蛋白的表達(dá)水平在頭部損傷后明顯下降，在傷后3天降到最低，此后逐漸恢復(fù)，到第7天基本恢復(fù)傷前水平，但之后逐漸升高，14天后表達(dá)水平明顯增高。DAI組各時(shí)段的NgR陽性蛋白表達(dá)均高于同時(shí)段正常對照組及假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NGF治療組能抑制DAI后NgR的表達(dá)，與同時(shí)段模型組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P值均<0.05。結(jié)論：NgR在大鼠受到腦外傷后表達(dá)顯著增高，其可抑制中樞神經(jīng)損傷后的再生，NGF能拮抗這一作用，從而可能在促進(jìn)腦外傷后神經(jīng)再生修復(fù)中起到作用。

【關(guān)鍵詞】彌漫性軸索損傷；神經(jīng)再生；NgR蛋白；神經(jīng)生長因子；免疫組化染色

【中圖分類號】R322.81【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1005-0019（2015）01-0056-02

隨著人類交際及流動范圍的迅速擴(kuò)大、延伸，伴之交通手段的快速發(fā)展，工業(yè)意外、生活意外、高速公路車禍等的發(fā)生率不斷上升，創(chuàng)傷的發(fā)生率躍居全球三大死因之一[1]。目前顱腦損傷的嚴(yán)重程度不斷加重，致殘率和死亡率極高，給社會和家庭都造成極大危害。彌漫性軸突損傷（DiffuseAxonalInjury，DAI）是TBI中最嚴(yán)重的類型之一。DAI系當(dāng)頭部遭受直線或旋轉(zhuǎn)加速性暴力時(shí)，因剪切力而造成的神經(jīng)軸索損傷。顱內(nèi)不同組織密度不一，在頭顱受到外力時(shí)所產(chǎn)生的加速度也不一樣。因此，這種損傷好發(fā)于不同密度的組織結(jié)構(gòu)之間。DAI屬原發(fā)性閉合性顱腦損傷，占顱腦損傷29%～53.5%。其臨床特點(diǎn)為病情危重，昏迷時(shí)間長，傷殘率和死亡率高[2]。目前認(rèn)為DAI可能是導(dǎo)致顱腦損傷病人植物生存或嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的最主要原因（顱腦傷后DAI引起的神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯是導(dǎo)致顱腦傷動物神經(jīng)功能障礙的主要原因）。

神經(jīng)生長因子（Nervegrowthfactor，NGF）的作用機(jī)理是縮短神經(jīng)肌肉動作電位潛伏期，并提高神經(jīng)肌肉動作電位幅度，減輕神經(jīng)髓鞘腫脹發(fā)生率和降低變性神經(jīng)纖維的數(shù)量，促進(jìn)損傷神經(jīng)的恢復(fù)。NGF可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和成熟，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性，對神經(jīng)纖維的生長方向起引導(dǎo)作用，NGF對神經(jīng)的保護(hù)和損傷修復(fù)作用，加速神經(jīng)纖維再生，減輕繼發(fā)性損傷。

本研究通過制備大鼠DAI標(biāo)準(zhǔn)模型，對DAI后大鼠分別肌肉注射鼠神經(jīng)生長因子，觀察各組大鼠腦組織NgR蛋白的表達(dá)，探討并觀察NGF對大鼠NgR表達(dá)的影響及對神經(jīng)損傷后的再生作用，為進(jìn)一步研究腦彌漫性軸索損傷有效治療方式提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物及試劑實(shí)驗(yàn)用SPF級SpragueDawley大鼠，雄性，體重250-300g（購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司）。飼養(yǎng)條件：2只/籠，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫維持25℃左右，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。動物隨機(jī)分為4大組：正常對照組，假手術(shù)組，腦損傷（DAI）模型組，DAI后NGF治療組。各組又分1d組、3d組、7d組、14d組，每組各5只。鼠神經(jīng)生長因子，18ug/支，廈門北大之路生物工程有限公司生產(chǎn)，18ug以2ml生理鹽水配制，治療組大鼠均每日按1ml/kg肌注1次；所有二抗、ABC和DAB試劑盒購自美國Vector公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DAI模型制備：采用MarmarouA等[3]的方法。稱重，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg）麻醉大鼠，頭頂部備皮，切開皮膚，分離各層組織，暴露顱骨項(xiàng)部位于冠狀縫和人字縫之間的顱骨穹隆處，將一直徑為lcm的不銹鋼墊片固定于人字縫之前，待大鼠意識狀態(tài)基本恢復(fù)正常后行頭部撞擊。將大鼠俯臥固定于致傷裝置的海綿床上。保證大鼠頭部位置端正，并使墊片的中央正對致傷裝置有機(jī)玻璃管的下口。重錘（鋼質(zhì)，50g）從指定的高處（1.5m）自由下落致圓盤形的墊片上，海綿床連同大鼠要在打擊后迅速撤離引導(dǎo)管下方以確保是單次打擊。檢查顱骨項(xiàng)部是否有骨折發(fā)生，縫合頭皮。棄除撞擊后死亡的大鼠以及顱骨發(fā)生骨折的大鼠，選取打擊后動物立即出現(xiàn)昏迷（驚嚇反射、角膜反射、痛覺反射消失），且昏迷時(shí)間長于3～5min，作為模型。假手術(shù)組的大鼠進(jìn)行同樣的撞擊前的手術(shù)及準(zhǔn)備，但不予以致傷。

1.2.2DAI后NGF治療組制備：DAI造模成功后，治療組大鼠均每日按1ml/kg肌注鼠神經(jīng)生長因子1次，注射部位為大腿后側(cè)肌肉。

1.2.3組織切片制備：致傷后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)10%水合氯醛麻醉大鼠，以O(shè).9%生理鹽水（200～300m1）行心腔灌注沖洗后，用多聚甲醛灌注固定液（約350m1）灌注固定，迅速斷頭取全腦，置于4%多聚甲醛固定液中后固定24h。組織塊經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋成塊。石蠟切片機(jī)水平面進(jìn)行連續(xù)的組織切片，切片厚度為4μm，經(jīng)展片后使用載玻片撈取切片烤干備用。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色：取脫蠟切片投入PBS緩沖液，經(jīng)抗原修復(fù)液95°C存放20min，緩沖液清洗2次，再入0.3%H2O2溶液內(nèi)室溫20min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清溶液中1小時(shí)，以減少非特異性反應(yīng)。一抗NogoR經(jīng)1%小牛血清與0.15%TritonX100緩沖液配制。每片滴加100μlNogoR（1：200）抗體中孵育4°C過夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應(yīng)抗兔二抗（1：400）溶液，室溫孵育1小時(shí)，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結(jié)合（ABC）試劑盒配置的混合液中培育1小時(shí)。底物呈色反應(yīng)劑采用DAB。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)逐級脫水并中性樹脂封片。每例標(biāo)本測5張切片，取被檢各區(qū)之均值。顯微鏡觀察拍照。

1.3圖像分析：在日本產(chǎn)NikonEclipse80i顯微鏡下觀察結(jié)果，并用NikonDS高分辨率數(shù)碼像機(jī)經(jīng)NIS-ElementsAR3.0軟件拍照。對每個(gè)組織切片均通過拍照收集全組織切面圖像。結(jié)果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數(shù)字采集及半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±s表示，治療前后均數(shù)的比較采用配對t檢驗(yàn)。用SPSS13軟件包進(jìn)行處理。以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況：存活大鼠打擊后多數(shù)即刻昏迷，呼吸暫停數(shù)秒至數(shù)十秒不等，自主呼吸恢復(fù)后呼吸由慢轉(zhuǎn)快，有的還可見張口呼吸、尖叫、呻吟等反應(yīng)。多數(shù)大鼠出現(xiàn)了持續(xù)15～30s甚至更長時(shí)間的全身痙攣，還有部分大鼠在昏迷期間出現(xiàn)了角弓反張、前肢屈曲等狀態(tài)。蘇醒后存活的大鼠以上癥狀會逐漸好轉(zhuǎn)，但普遍出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、活動和進(jìn)食減少的現(xiàn)象，也有嚴(yán)重者會遺留前肢肌力下降、偏癱、腸梗阻或腸穿孔等癥狀，約有70%以上的大鼠打擊后存活。

2.2免疫組化染色：NgR陽性細(xì)胞主要分布于大腦皮層、皮層下、海馬、下丘腦等處，其中在大腦皮層與海馬相連部位的少突膠質(zhì)細(xì)胞有很強(qiáng)的免疫陽性反應(yīng)。NgR免疫反應(yīng)陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞主要為橢圓形，可有明顯的突起。實(shí)驗(yàn)選取大腦皮層與海馬CA1區(qū)之間部位中陰性和陽性計(jì)數(shù)后計(jì)算陽性率。如表1所示：致傷后1天，NgR表達(dá)輕度下降；到第3天，軸索的NgR表達(dá)則有較明顯下降（P<0.05）；到致傷后第7天，軸索的NgR表達(dá)恢復(fù)至正常時(shí)水平；進(jìn)展至致傷的第14天，NgR表達(dá)有較明顯的升高。NGF治療組在每個(gè)時(shí)間段的NgR表達(dá)水平均明顯較DAI模型組低（P<0.05）。

3討論

顱腦損傷后高致殘率和死亡率的原因很大程度上要?dú)w于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）再生障礙。在CNS的再生修復(fù)過程中，神經(jīng)抑制因素被認(rèn)為占據(jù)優(yōu)勢。CNS環(huán)境中的抑制作用主要來源于兩方面：膠質(zhì)瘢痕和髓鞘，后者是由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成。髓鞘相關(guān)蛋白（MAG）、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（OMgp）及Nogo蛋白是三種主要的髓鞘蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的對中樞神經(jīng)再生起抑制作用的主要物質(zhì)。它們通過與Nogo66受體（NgR）結(jié)合靶動一系列再生抑制進(jìn)程。NgR通過與上述三種髓磷脂相關(guān)蛋白結(jié)合，接受來自這些抑制分子的抑制信號，是三種髓磷脂相關(guān)蛋白的作用焦點(diǎn)。通過NgR受體復(fù)合物的介導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)的RhoA信號通路被激活，最終導(dǎo)致神經(jīng)元軸突生長錐的潰變，阻斷軸突的再生[4]。由于NgR在軸突再生抑制信號的胞內(nèi)外傳導(dǎo)途徑中起著樞紐作用，在NgR這一環(huán)節(jié)阻斷抑制信號的傳導(dǎo)可以促進(jìn)中樞神經(jīng)的再生。

神經(jīng)生長因子（NGF）遍布于神經(jīng)元的胞體、胞質(zhì)和突起，也廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)的組織和器官。NGF其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：①在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中主要表現(xiàn)為促進(jìn)神經(jīng)元的分化、誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長、控制神經(jīng)元存活的數(shù)量、刺激胞體和樹突的發(fā)育以及影響神經(jīng)纖維支配靶區(qū)的密度。②在損傷的神經(jīng)元其作用主要表現(xiàn)在保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)、抗神經(jīng)元凋亡以及促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，減少受損神經(jīng)細(xì)胞的死亡和調(diào)控受損神經(jīng)元的基因表達(dá)，促進(jìn)效應(yīng)神經(jīng)元功能的修復(fù)，通過受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，激活各種分化因子，發(fā)揮神經(jīng)趨化作用，引導(dǎo)和加快軸突再生長[5]。

本次研究發(fā)現(xiàn)NgR蛋白在致傷后1天稍有下降，第3天明顯下降，第7天恢復(fù)近正常水平，14天后又明顯升高。上述結(jié)果說明DAI誘導(dǎo)腦組織的NgR蛋白水平下降，從而降低Nogo-A及其他髓鞘生長抑制物的作用，為再生修復(fù)創(chuàng)造有利條件，但這種自身機(jī)體的下調(diào)持續(xù)時(shí)間顯然并不夠長久，還不足以維持到損傷軸索的完全修復(fù)。應(yīng)用NGF治療的組別，其NgR的表達(dá)較模型組受到明顯的抑制。本研究結(jié)果表明，在DAI早期應(yīng)用NGF，可以抑制腦組織中NgR蛋白的表達(dá)，促進(jìn)受損神經(jīng)的再生及修復(fù)。其作用機(jī)制可能是NGF可以通過介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Nogo抗體信號的傳導(dǎo)，阻斷Nogo、MAG及Omgp與NgR的結(jié)合，拮抗Nogo蛋白等抑制中樞神經(jīng)元軸突再生及誘導(dǎo)軸突生長錐潰變作用，由此可能在促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生修復(fù)中起到重要作用。

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