應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測mTOR和VEGF在結(jié)腸癌中的表達1

高碩徽

【摘 要】目的：探討雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在臨床結(jié)腸癌患者中的表達，并針對兩者與結(jié)腸癌病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)性。方法：選取72例結(jié)腸癌標本的組織芯片，采用免疫組化對mTOR以及VEGF進行檢測，經(jīng)過結(jié)果分析兩者在結(jié)腸癌狀態(tài)下與正常結(jié)腸組織中的表達，同時根據(jù)結(jié)果對mTOR、VEGF與結(jié)腸癌臨床參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)性進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：mTOR在結(jié)腸癌中的總表達率為42.5%，在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達率為21.3%；VEGF在結(jié)腸癌中的總表達率為60.2%，在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達率為40.4%，mTOR與VEGF在結(jié)腸癌當中的表達率明顯高于在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達率，比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。mTOR表達率與性別、年齡等患者基本資料之間無明顯的相關(guān)性，但mTOR與VEGF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤深度等情況呈明顯的正相關(guān)性，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關(guān)性。結(jié)論：mTOR與VEGF可作為結(jié)腸癌發(fā)展中的重要指標進行觀察，同時mTOR與VEGF也可以作為結(jié)腸癌的靶點應(yīng)用于臨床當中。

【關(guān)鍵詞】雷帕霉素靶蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；結(jié)腸癌；組織芯片；免疫組化

Abstract：objective：to investigate the rapamycin target protein（mTOR）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in clinical patients with colon cancer，and for the correlation between pathological parameters with colon cancer.Methods：choose 72 cases of colon cancer specimens of tissue microarray，of the mTOR and VEGF by immunohistochemical detection，through the analysis of both in the condition of colon cancer and normal colon tissue expression，at the same time，according to the results of mTOR，correlation between VEGF and colon cancer clinical parameters were analyzed.Results：the total expression of mTOR in colon cancer at a rate of 42.5%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 21.3%；Total expression of VEGF in colon cancer at a rate of 60.2%，in the normal colonic mucosa tissue expression rate is 40.4%，mTOR and the expression rate of VEGF in colorectal cancer were significantly higher than those in normal colonic mucosa tissue expression rate of comparative differences statistically significant（P < 0.05）.MTOR expression rate of patients with gender，age and other basic data have no obvious correlation between，but mTOR and VEGF in lymph node metastasis，tumor infiltration depth，and so on and so forth are obvious positive correlation，also exist obvious positive correlation between mTOR and VEGF.Conclusion：the mTOR and VEGF can be used as an important index to observe in colon cancer development，at the same time mTOR and VEGF can also be used as a target for clinical application of colon cancer.

Key words：rapamycin target protein；Vascular endothelial growth factor；Colon cancer；Tissue chip；immunohistochemical

近些年來結(jié)腸癌發(fā)病率的上升，主要是由于人們生活方式的改變，更多的食物擺上了餐桌，其中包含的大量致結(jié)腸癌物質(zhì)使得結(jié)腸癌位于目前致死惡性腫瘤第5位的排名。據(jù)我國維生組織的統(tǒng)計結(jié)果表明，全球范圍內(nèi)的結(jié)腸癌發(fā)病率以每年3%的速度逐年遞增，而我國則以每年4%的速度增加[1]。在以往針對結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展的研究當中，認為結(jié)腸癌與多個步驟、多個癌基因、多個抑癌基因以及調(diào)控信號通路的異常變化之間有顯著的相關(guān)性，多基因、多因素與多步驟成為了結(jié)腸癌特殊的發(fā)病機理。mTOR與VEGF是目前世界上生物學研究當中惡性腫瘤的研究熱點之一，mTOR的作用在于能夠感受營養(yǎng)信號，進而對細胞的生長與增殖能夠起到關(guān)鍵的促進作用，在多種惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程當中均存在明顯的相關(guān)性與高表達率。本次研究采用免疫組織化學檢驗與組織微陣列針對mTOR與VEGF在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸粘膜組織中的表達情況進行研究，進而探討結(jié)腸癌生物學相關(guān)行為的臨床意義。

1 材料及方法

1.1 標本選取

選取2011年-2015年某院實驗室當中的72例結(jié)腸癌石蠟標本作為本次的研究對象，所有標本均通過2名以上的專業(yè)病理醫(yī)師檢查并確診，另外選取原發(fā)癌灶邊緣>2cm的正常結(jié)腸粘膜組織作為參照物。

1.2 組織芯片

在石蠟標本組織蠟塊的選取當中，采用HE切片并針對具有代表性的病變部位進行確認，同時區(qū)分原發(fā)癌灶與正常粘膜組織，隨后采用應(yīng)用芯片組織構(gòu)建儀對組織芯片進行制備。

1.3 檢測方法

抗mTOR抗體選自英國ABcam公司（Dilution，1：50；Clone Y391），抗VEGF抗體選自美國Lab Vision公司（Dilution，1：200；Clone SP28），免疫組化試劑盒選取丹麥Dako公司的EnVision免疫組化試劑盒，采用EnVision二步法作為本次研究中的免疫組化技術(shù)，采用PBS代替一抗進行陰性對照[2]。

1.4 結(jié)果判斷標準

mTOR主要存在于細胞漿當中，而VEGF則在細胞質(zhì)與細胞漿當中均可定位，經(jīng)染色后陽性標本呈淡黃色、棕褐色或棕黃色。陽性細胞數(shù)計分標準采用二級計分法，對5個高倍鏡的視野對陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計：陽性細胞數(shù)<5%時，計0分；25%>陽性細胞數(shù)>5%時，計1分；50%>陽性細胞數(shù)>25%時，計2分；75%>陽性細胞數(shù)>50%時，計3分；陽性細胞數(shù)≥75%時，計4分。對染色強度進行分類后采用二級計分法，對染色后的陽性細胞進行統(tǒng)計：細胞呈淡黃色時，計1分；細胞呈黃色或深黃色時，計2分；細胞呈褐色或棕褐色時，計3分。將上述兩組標準統(tǒng)計后的積分相乘，>1分時即可判定為陽性[3]。

1.5 統(tǒng)計學處理

本次研究當中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計數(shù)資料采用數(shù)（n）率（%）表示，數(shù)據(jù)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建組織芯片

本次研究當中共構(gòu)建成功1張組織芯片，其中包含了143個位點，脫落點采用常規(guī)切片予以補充。在癌組織當中，mTOR與VEGF染色的陽性細胞均呈片狀并大面積出現(xiàn)，mTOR在細胞漿中表達率較高，且呈強陽性，正常結(jié)腸粘膜組織經(jīng)染色后不著色，部分細胞呈弱陽性。VEGF在細胞漿與細胞質(zhì)當中均表達率較高，且呈強陽性，正常結(jié)腸粘膜組織經(jīng)染色后不著色。

表1 mTOR及VEGF陽性表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性[n（%）]

臨床參數(shù) 病例數(shù) mTOR+ VEGF+

性別

男 45 20（44.44） 27（60.00）

女 27 13（48.15） 19（70.37）

年齡

<60 39 15（38.46） 23（58.97）

≥60 33 18（54.55） 21（63.64）

浸潤深度

粘膜層與肌層 29 11（37.93）* 15（51.72）*

漿膜層及漿膜外 43 23（53.49） 31（72.09）

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

陽性 34 21（61.76）* 30（88.24）**

陰性 38 14（36.84） 16（42.11）

遠處轉(zhuǎn)移

陽性 24 21（87.50）** 19（79.17）**

陰性 48 12（24.00） 23（47.92）

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 原發(fā)癌與正常結(jié)腸粘膜組織中mTOR與VEGF的表達率

mTOR在結(jié)腸癌組織當中的表達率為42.5%，可隨著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展逐漸增加，在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達率為21.3%；VEGF在結(jié)腸癌組織當中的表達率為60.2，在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達率為40.4%。結(jié)腸癌組織中的mTOR與VEGF的表達率均明顯高于在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達率，比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 mTOR與VEGF陽性表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

mTOR表達率與患者的性別、年齡均無明顯的關(guān)聯(lián)性，與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、浸潤深度均呈明顯的正相關(guān)性，VEGF表達率與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、浸潤深度呈明顯的正相關(guān)性，具體數(shù)據(jù)見表1。

2.4 mTOR與VEGF的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，mTOR與VEGF之間存在顯著的相關(guān)性。mTOR與VEGF在結(jié)腸癌當中的共同表達率為37.8%（r=0.351，P<0.05），結(jié)果表明兩者之間存在明顯的正相關(guān)性。

3 討論

mTOR屬于蘇氨酸激酶/絲氨酸的一種，在營養(yǎng)信號的感受、細胞生長與增值當中具有極強的調(diào)節(jié)作用，通常情況下，細胞的增長與能量狀態(tài)、血液供給情況以及營養(yǎng)等因素具有極強的相關(guān)性，mTOR能將這些因素進行整合，對細胞的生長進行調(diào)節(jié)[4]。與正常細胞相同的是，癌細胞的成長也需要能量、營養(yǎng)以及血液的供給，因此VEGF存在的介導生物學作用在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程當中能夠起到重要的作用[5]。本次研究結(jié)果表明，在正常的結(jié)腸粘膜組織當中，mTOR基本不表達，在惡性腫瘤組織當中，mTOR的表達率為42.5%，而VEGF在惡性腫瘤組織當中的表達率則高達60.2%，mTOR與VEGF之間也存在明顯的正相關(guān)。

本次研究針對mTOR與VEGF在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移當中據(jù)存在明顯的作用，在臨床研究中不僅能夠?qū)Y(jié)腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制進行深入的了解，同時也能成為惡性腫瘤的待選治療靶點，在臨床當中具有重要的實際價值與意義。

參考文獻：

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