牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的檢測方法

王坤

【摘要】牛奶制品中的青霉素酶是奶制品的安全風(fēng)險物之一。由于青霉素的價格低廉，療效確切，經(jīng)常被用來治療奶牛乳腺炎，然而，青霉素的濫用導(dǎo)致牛乳中的青霉素殘留已經(jīng)成為廣大消費者關(guān)注的重點。青霉素酶屬于β-內(nèi)酰胺酶，可水解青霉素類的β-內(nèi)酰環(huán)，使青霉素水解為青霉噻唑酸。青霉噻唑酸可與T細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合物（MHC）或與鑲嵌在細(xì)胞內(nèi)的多肽結(jié)合，所形成的復(fù)合物激發(fā)T細(xì)胞，從而引起過敏反應(yīng)。因此對于牛奶制品中青霉素酶進(jìn)行檢測具有重要的意義。

【關(guān)鍵詞】牛乳制品；青霉素酶；Alphalisa檢測方法

一、β-內(nèi)酰胺酶檢測方法及原理

現(xiàn)有的青霉素酶的檢測方法有碘量法、酸度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、頭孢硝噻吩顯色法以及杯碟法等。碘量法是《中國藥典》中規(guī)定的檢測β-內(nèi)酰胺酶活性的方法，該法方便快捷、檢出限高?，F(xiàn)階段，牛乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法采用的是衛(wèi)生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗方法杯碟法》，該方法可以檢測出生鮮乳中未反應(yīng)完全的β-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測未經(jīng)過任何加工的牛奶，并且檢出限較低，容易區(qū)分外源性和內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶。其檢測原理是以一種對青霉素高度敏感的細(xì)菌作為指示菌，實驗時如果被測牛奶樣品含有青霉素酶，破壞了青霉素，指示菌株即可生長，否則指示菌將被抑制。同時，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對抑菌圈的大小，可以定量地確定β-內(nèi)酰胺酶的含量。崔生輝等運用β-內(nèi)酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測方法，該方法在牛奶中的檢出限為4U/mL。目前，微生物法仍然是實驗室檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的主要方法。

二、材料和方法

（一）材料和試劑

青霉素酶（P0389，sigma）；Zeba Spin 脫鹽柱（89889，Thermo Scientific）；青霉素酶抗體（ab12251，Abcam）；青霉素酶（ab10712，Thermo Scientific）；Chroma Link? Biotin （B-1001-010， Solulink）；雞抗鼠 IgG （ab6706，Abcam）；Alpha Screen? Streptavidin Donor beads（6760002，perkinelmer）；Alpha Screen? Unconjugated Acceptor Beads（6762001，perkinelmer）。

（二）方法

2.1抗原的純化及生物素化

抗原的純化：將青霉素酶溶解于修飾緩沖液（100mmol/L 磷酸鈉，150mmol/L NaCl， pH8.0）中， 用Zeba Spin脫鹽柱進(jìn)行液體交換和脫鹽凈化。凈化過程：取出低溫保存的脫鹽柱，回復(fù)室溫，去掉脫鹽柱底端封口帽，開蓋，將柱子放入收集管中。4℃，1500r/min離心2min，去除保存液。向柱子中加入合適體積的待交換溶液，洗柱，4℃，1000r/min 離心2min，重復(fù)2～3次。將柱子放入新的收集管中，慢慢將適量的樣品注入樹脂的中心位置。5mL的柱子上樣量為500～2000?L。4℃，1000r/min離心2min，收集樣品。A280nm測定蛋白濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），確定蛋白的相對分子質(zhì)量。

青霉素酶的生物素化：用修飾緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到1～2mg/mL。計算抗原和生物素化試劑的比例，取53?L脫鹽后的抗原溶液加入4.6?L的Chromalink Biotin的二甲基甲酰胺溶液（取1mg Chromalink Biotin加入100?L無水二甲基甲酰胺中即成）中，室溫條件下結(jié)合90min。同前進(jìn)行脫鹽，也交換緩沖體系為Alphalisa檢測緩沖液（含25mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%干酪素，1mg/mL葡聚糖T500，pH7.4）中，分光光度計測定A280nm和A354nm的值，計算摩爾替換比率。

2.2受體磁珠偶聯(lián)抗鼠IgG

取5～50?L（20mg/mL）的受體磁珠于1.5mL的離心管中，加入50?L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4），14000r/min離心15min，去上清液?，F(xiàn)配400mmol/L NaBH3CN溶液，然后按照每5?L受體磁珠和10?L抗小鼠IgG抗體（1mg/mL）、1?L NaBH3CN、0.125?L的10%吐溫20以及3.875?L的HEPES Buffer 37℃輕柔振蕩反應(yīng)18～24h。然后加入10?L 65mg/mL的CMO溶液（用800mmol/L的NaOH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用），37℃，輕柔振蕩反應(yīng)1h。然后4℃、14000r/min離心15min，去上清液，然后加入200?L的100 mmol/L Tirs-HCl（pH8.0）重懸磁珠。隨即進(jìn)行10次超聲振蕩（每次1s），4℃、14000r/min離心15min，去上清液。然后加入Tirs-HCl（pH8.0）溶液，同前進(jìn)行第二次超聲，離心，去上清液，加200?L的PBS（含0.05%的Proclin-300），渦旋振蕩，同前簡短超聲，避光保存。

2.3Alphalisa檢測

檢測反應(yīng)體系采用反向競爭模式，檢測過程均在室溫條件下完成，具體操作如下：取青霉素酶溶解于檢測緩沖液中，然后取5?L該溶液和等體積的抗青霉素酶單克隆抗體反應(yīng)1h，形成抗原抗體復(fù)合物；然后加入5?L生物素化青霉素酶反應(yīng)0.5h，競爭結(jié)合游離的抗青霉素酶單抗；接著加入各5?L的抗鼠IgG包被受體磁珠工作液和鏈親和素供體磁珠工作液，避光反應(yīng)0.5h，最終形成供體磁珠-生物素化青霉素酶-抗青霉素酶單抗-受體磁珠復(fù)合物。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa檢測模塊中，以680nm波長處的入射光下發(fā)生熒光共振能力轉(zhuǎn)移，單體氧傳遞到受體磁珠上，同步激發(fā)波長615nm的發(fā)射光，記錄反應(yīng)的信號值。

三、結(jié)論

青霉素酶的殘留給乳制品的質(zhì)量安全帶來了極大的危害。將Alphalisa檢測方法應(yīng)用于青霉素酶的檢測主要的挑戰(zhàn)是基質(zhì)樣品的復(fù)雜性。在Mechaly等的實驗結(jié)果表明Alphalisa法可以克服基質(zhì)樣本的復(fù)雜性。該研究將Alphalisa方法應(yīng)用于環(huán)境樣品中炭疽孢子的檢測，靈敏度達(dá)到106孢子/m L。本研究的結(jié)果也表明，不同的牛乳制品對反應(yīng)均有一定程度的抑制，但是通過離心、過濾的處理后，都能在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性反應(yīng)規(guī)律。由于Alphalisa檢測反應(yīng)一直處于均相的液體環(huán)境下反應(yīng)，檢測限低于常規(guī)的同類方法。由于沒有洗板的過程，Alphalisa檢測的時間大大縮短，比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附方法縮短1～2 h。由此可見，Alphalisa方法在復(fù)雜樣品中進(jìn)行快速、高靈敏度的檢測能力極強，有望成為常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附方法的替代方法。