實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清/血漿microRNAs臨床應(yīng)用前的準(zhǔn)備

鄧開(kāi)鳳 戴盛明★

·綜述·

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清/血漿microRNAs臨床應(yīng)用前的準(zhǔn)備

鄧開(kāi)鳳 戴盛明★

現(xiàn)已證明血清/血漿microRNAs（miRNAs）表達(dá)譜的變化與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。血清/血漿miRNAs分子穩(wěn)定，不易降解，且標(biāo)本采集創(chuàng)傷小、便捷，非常適合應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。因此miRNAs極有可能成為未來(lái)疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物乃至治療靶標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）操作簡(jiǎn)便，需要的RNA量較少，靈敏度極高，能在短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，并可同時(shí)檢測(cè)多種miRNAs表達(dá)，有良好的應(yīng)用前景。本文將詳細(xì)探討現(xiàn)階段用于血清/血漿miRNAs定量檢測(cè)的RT-qPCR方法，以及總結(jié)血清/血漿miRNAs定量檢測(cè)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)應(yīng)注意的問(wèn)題。

MicroRNAs；血清/血漿；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

miRNAs發(fā)現(xiàn)始于1993年，Lee等研究人員在秀麗新小桿線蟲(chóng)（caenorhabditis elegans，C. elegans）中意外發(fā)現(xiàn)控制著線蟲(chóng)時(shí)序性發(fā)育的雙鏈小RNA分子lin-4［1］。直至2000年，Reinhart［2］等發(fā)現(xiàn)第二個(gè)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的RNA小分子let-7，miRNAs才逐漸進(jìn)入人們的視野成為一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域。越來(lái)越多的研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類具有調(diào)控調(diào)控作用的小RNA分子。目前人們普遍的共識(shí)是：miRNAs是一類高度保守，長(zhǎng)度在19～24個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）左右的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。而外周血循環(huán)miRNAs是組織細(xì)胞分泌產(chǎn)生［3］，成熟的miRNAs在細(xì)胞內(nèi)被脂質(zhì)或脂蛋白包被成外切酶體（exosome），分泌至胞外并進(jìn)入血液，外切酶體通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞，釋放出miRNAs發(fā)揮生物學(xué)功能［4］。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物miRNAs能調(diào)控超過(guò)60％的基因，在細(xì)胞發(fā)育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［5］。疾病時(shí)期，血清/血漿中相關(guān)miRNAs表達(dá)譜以及含量的改變提示人們miRNAs或可成為一種新的有助于疾病預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后的標(biāo)志物［6］。血清/血漿miRNAs的穩(wěn)定使其定量檢測(cè)成為可能。由于miRNAs分子量小，表達(dá)水平極低，因而需要極為靈敏的定量分析方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）被認(rèn)為是miRNAs定量的金標(biāo)準(zhǔn)［7］，本文將詳細(xì)探討現(xiàn)階段用于血清/血漿miRNAs定量檢測(cè)的RT-qPCR技術(shù)及存在的問(wèn)題。

1　血清/血漿miRNAs實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

RT-qPCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。其能在短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNAs表達(dá)，需要的miRNAs量較少（1～10 ng總RNA），因而特別適合于miRNAs含量極低的血清/血漿檢測(cè)［8］。miRNAs是極有吸引力的候選生物標(biāo)志物，而RT-qPCR檢測(cè)血清/血漿miRNAs如要應(yīng)用于臨床，在實(shí)驗(yàn)的每個(gè)階段都必須有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，才能獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的結(jié)果，包括分析前的質(zhì)量控制，如標(biāo)本的選擇，采集與運(yùn)送保存；分析中miRNAs提取操作流程，cDNA的合成策略，RT-qPCR中引物設(shè)計(jì)，校參選擇，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，都應(yīng)具備最可靠的溯源。

1.1分析前

標(biāo)本的選擇，采集與運(yùn)送保存：盡管miRNAs［9-11］在其他體液如乳汁、尿液甚至是唾液中也存在（含量更微），但血液檢測(cè)最方便、可信，因此血液檢測(cè)仍然是目前臨床上最常用的檢測(cè)標(biāo)本。已有實(shí)驗(yàn)證明［12］，血漿與血清miRNAs含量無(wú)明顯差異，且具有很強(qiáng)的相關(guān)性，均適合作為疾病的標(biāo)志物檢測(cè)樣本。實(shí)驗(yàn)室定量實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)前期目的miRNAs篩選樣本，或者通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)選取最佳的樣本類型，如是血漿還需注意抗凝劑對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響［13］。標(biāo)本細(xì)胞殘留、溶血、脂血、黃疸對(duì)檢查都有影響：某些目的miRNAs在血細(xì)胞中亦有表達(dá)［14-15］，則須在血清/血漿收集時(shí)優(yōu)化離心力的大小、離心次數(shù)，以盡可能的消除殘余細(xì)胞污染；溶血可干擾PCR反應(yīng)過(guò)程［16］，則應(yīng)避免造成血球破裂的動(dòng)作，如用太細(xì)的針頭抽血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血或溶血現(xiàn)象等可能影響結(jié)果的因素都必須列入評(píng)估；脂血、黃疸等異常標(biāo)本也應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生何種影響。

miRNAs在血清/血漿中存在較穩(wěn)定［17］，耐RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境等各種處理方法均不會(huì)造成miRNAs損失［4，18］，但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，依然能觀察到血清/血漿miRNAs會(huì)發(fā)生不同程度的降解［19］。因此需要制定統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)本采集、運(yùn)送與分裝保存流程，以期盡可能減少miRNAs的降解，保證檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，以及不同病程時(shí)期結(jié)果的可比性。

1.2分析中

1.2.1miRNAs提取

目的miRNAs提取量的多少直接決定后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。血清/血漿miRNAs分子量小，且含量極低，如何從樣本中分離出全面、且濃度高的RNA組分是miRNAs檢測(cè)的前提。目前實(shí)驗(yàn)室常用的RNA提取純化方法，如有機(jī)溶劑抽提加乙醇沉淀法，能較好地保留小分子RNA，然而后續(xù)的脫鹽和沉淀步驟容易導(dǎo)致miRNAs流失、鹽類和有機(jī)溶劑殘留，影響定量實(shí)驗(yàn)操作反應(yīng)［20］；而硅膠膜離心柱法只能富集較大分子的RNA（＞200 nt），小分子RNA往往被漏掉，因而不適用于小分子RNA的分離純化。這兩種方法都存在標(biāo)本需要多、人為誤差大、提取效率有差異、獲得的miRNAs種類及數(shù)量差異大等缺點(diǎn)［21］，因此無(wú)法保證miRNAs檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。商品化的試劑盒因其優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)一的操作流程，能有效快速地純化miRNAs，實(shí)現(xiàn)樣本處理的標(biāo)準(zhǔn)化，因此選擇最優(yōu)的miRNAs提取試劑盒是保證結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確的另一前提。

1.2.2cDNA合成

成熟的miRNAs只有19～24 nt，無(wú)Poly A尾，使得miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄較mRNA更為復(fù)雜。目前，miRNAs逆轉(zhuǎn)錄的方法主要有特異性莖環(huán)引物法和miRNAs加尾法。莖環(huán)引物法［22］（見(jiàn)圖1）針對(duì)目的miRNAs設(shè)計(jì)一段特殊的莖環(huán)狀引物，該引物中除含有一段與被檢miRNAs互補(bǔ)的特異序列外，還含有一段較長(zhǎng)的本身有部分堿基互補(bǔ)配對(duì)并形成環(huán)狀的共有序列。莖環(huán)狀引物與被檢miRNAs退火反轉(zhuǎn)錄后，能得到一段較長(zhǎng)的cDNA，然后以此為模板，針對(duì)特異的miRNAs設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一條miRNAs序列特異對(duì)應(yīng)一個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物；miRNAs加尾法則先利用Poly（A）聚合酶對(duì)總RNA進(jìn)行加尾處理，使所有miRNAs的3′端加上一段Poly（A）尾，然后用帶有特殊Poly（T）接頭序列的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以此為模板，針對(duì)目的miRNAs設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

與莖環(huán)狀引物法相比，RNA加尾法的最大優(yōu)點(diǎn)是能一次性對(duì)所有的miRNAs進(jìn)行加尾反應(yīng)，將所有的miRNAs反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA，操作及引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，但是RNA在反轉(zhuǎn)錄前需要進(jìn)行末端Poly（A）加尾，特異性稍低。因此，莖環(huán)法可特異針對(duì)成熟的目標(biāo)miRNAs，是目前最常用的定量檢測(cè)已知miRNAs方法。綜合比較，設(shè)計(jì)特異的莖環(huán)狀引物針對(duì)目的miRNAs是血清/血漿定量檢測(cè)的較好選擇，其優(yōu)點(diǎn)在于可以不用對(duì)miRNAs進(jìn)行加尾，防止引物與miRNAs前體及其他RNA結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄引物5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成的堿基堆積和空間限制能顯著增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄的特異性，同時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)后可以增加miRNAs的長(zhǎng)度，為PCR擴(kuò)增提供合適的模板。primer5.0、DNAstar、dnaman以及miRprimer都可以設(shè)計(jì)miRNAs特異性莖環(huán)引物，選擇其中最合適的引物進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.3qPCR引物設(shè)計(jì)

研究人員發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的miRNAs，其同一家族的miRNAs序列往往相似，有時(shí)只有一個(gè)堿基差異［8］。特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物合成后，cDNA的qPCR特異性引物設(shè)計(jì)又是一大挑戰(zhàn)。通常，上游引物是根據(jù)miRNAs自身序列設(shè)計(jì)，如GC含量太低，可以在上游引物5′端加入GCGCC等的保護(hù)堿基；下游引物則在RT引物的反向互補(bǔ)序列中找。也即上游引物是每個(gè)miRNAs所特有的，下游引物為通用引物。通常情況下，上游引物序列與待測(cè)miRNAs序列基本一致，并將原有的U替換成T，通過(guò)增加或減少堿基來(lái)調(diào)整Tm值與下游引物接近即可。

圖1　頸環(huán)法real-time PCR原理圖［22］Figure 1Schematic description of stem-loop RT real-time PCR［22］

1.2.4校參選擇

qPCR結(jié)果需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以消除非生物學(xué)變化對(duì)結(jié)果的影響，使用外源性小RNA或內(nèi)源性基因是兩種標(biāo)準(zhǔn)化的常用介質(zhì)。早先研究人員使用外源性小RNA校正qPCR定量結(jié)果，如線蟲(chóng)的miR-39［23］、miR-238［24］等。但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，如果把純化出的miRNAs加入到血清/血漿中時(shí)，會(huì)發(fā)生降解的現(xiàn)象［25］。因此，外源性小RNA不能很好的監(jiān)測(cè)miRNAs的提取效率，更無(wú)法校正cDNA合成效率以及qPCR定量結(jié)果，而不具有參照作用。這一結(jié)果也提示研究人員在目的miRNAs提取后應(yīng)采取措施避免靶核酸的降解，盡快進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄以及定量PCR反應(yīng)。

內(nèi)源性基因是目前使用最廣泛的校參策略。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在所要研究的疾病體系或樣品類型中都表達(dá)恒定。早前的內(nèi)源性基因如miR-16，在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色［3］，并且在癌癥患者與正常對(duì)照之間表達(dá)有顯著差異，溶血也會(huì)影響miR-16含量檢測(cè)［26］，說(shuō)明其無(wú)法作為某一疾病的內(nèi)參；而U6 snRNA（簡(jiǎn)稱U6），在血清血漿中表達(dá)水平較低，并且在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明也無(wú)法勝任肝臟疾病的內(nèi)參［27］?？梢?jiàn)必須根據(jù)病種篩選適合試驗(yàn)體系的特異性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因［28］。采用多個(gè)內(nèi)源性基因以組合的方式作為內(nèi)參的研究，Chen［29］利用Illumina篩選檢測(cè)以及RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)血清中Let-7d、Let-7g和Let-7i的miRNAs組合模式優(yōu)于前人用過(guò)的U6、RNU44、RNU48等，并可作為多種疾病定量的內(nèi)參選擇。專用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的軟件，如GeNorm、BestKeeper和NormFinder，在研究某一疾病miRNAs表達(dá)譜變化時(shí)，即可利用以上軟件確定在疾病患者樣本中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因［30-31］。Han利用NormFinder和BestKeeper程序軟件發(fā)現(xiàn)U6與miR-192既可以單獨(dú)也可以組合的模式用于胸腔積液合并肺膿腫與肺腺癌惡性腫瘤病人血清RT-qPCR的內(nèi)參選擇［32］。Fritz［33］則提出利用樣本自身miRNAs（21/ 10b）定量比值作為腎透明細(xì)胞癌的一個(gè)血清標(biāo)志物，直接簡(jiǎn)便，前提是通過(guò)大樣本的標(biāo)準(zhǔn)化篩選實(shí)驗(yàn)證明該比值的敏感性與特異性達(dá)到臨床診斷的要求。Albonico發(fā)現(xiàn)miR-17-5p/miR-155比值可作為犬脾淋巴癌的分子診斷工具［34］。

1.2.5RT-qPCR產(chǎn)物檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

qPCR產(chǎn)物檢測(cè)主要有SYBR-Green I和TaqMan探針2種方法，目前主流使用的是TaqMan探針。TaqMan探針與特異性產(chǎn)物結(jié)合的短序列，其5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端含有淬滅基團(tuán)，探針完好時(shí)淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，Taq酶水解探針，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)，每合成一個(gè)雙鏈就產(chǎn)生一個(gè)熒光信號(hào)被儀器捕捉。TaqMan探針不受miRNAs前體、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾，對(duì)于家族miRNAs的檢測(cè)特異性高。

RT-qPCR數(shù)據(jù)分析存在許多種算法。其中最簡(jiǎn)單原始的方法是ΔCt法，此法僅分析Ct值，公式為：ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），不考慮擴(kuò)增效率的影響，即認(rèn)為目的miRNAs與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都為100％，所以無(wú)法準(zhǔn)確估計(jì)目的miRNAs的初始含量。2-ΔΔCT法則在ΔCt法的基礎(chǔ)上，將每一組樣本每一個(gè)目的基因的ΔCt減去對(duì)照組樣本的ΔCt，并同時(shí)對(duì)所有結(jié)果取相反數(shù)（即加一個(gè)負(fù)運(yùn)算，正數(shù)變?yōu)樨?fù)數(shù)，負(fù)數(shù)變?yōu)檎龜?shù)），該步運(yùn)算得到的結(jié)果即為-ΔΔCt。最后，對(duì)-ΔΔCt進(jìn)行2的冪運(yùn)算，即2-ΔΔCT得出倍數(shù)變化值（fold change）。fold change值具有放大效應(yīng)，可體現(xiàn)兩組樣本的差異趨勢(shì)，但容易出現(xiàn)目的miRNAs含量被高估的情況。美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（applied biosystems，ABI）提供的一個(gè)分析方法是計(jì)算log2R，即log2為底對(duì)R求對(duì)數(shù)，R就是2-ΔΔCT。綜合以上分析，事實(shí)上，計(jì)算出-ΔΔCt這一步即可，得到的正值表示較對(duì)照組miRNAs上調(diào)，負(fù)值表示較對(duì)照組miRNAs下調(diào)，數(shù)據(jù)圖非常直觀，也沒(méi)有放大效應(yīng)，顯著性分析較為準(zhǔn)確。這種運(yùn)算方法關(guān)鍵在于ΔΔCt取相反數(shù)，以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組劃分清晰，才能得到正確的結(jié)果。當(dāng)然，也可根據(jù)目的miRNAs（含量低）定量的目標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，將誤差控制在最小范圍的情況下，選擇相應(yīng)的計(jì)算方法，如可放大效應(yīng)的2-ΔΔCT法。數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，不合理的分析會(huì)得到錯(cuò)誤結(jié)果，因此需要通過(guò)對(duì)RT-qPCR的每一組分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)以達(dá)到最小化變異性和最大化可重復(fù)性，而且還需要沿用一個(gè)通用的數(shù)據(jù)分析方法以達(dá)到臨床診斷需要的基因表達(dá)分析標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3分析后

臨床標(biāo)本血清/血漿miRNAs在RT-qPCR檢測(cè)后，通常涉及檢驗(yàn)樣本的保存，以備復(fù)查。未提取miRNAs的原始血清/血漿可根據(jù)臨床的需要，如監(jiān)測(cè)疾病的始末以及后續(xù)對(duì)疾病的研究等，通過(guò)分裝保存于-80℃或液氮的方式長(zhǎng)期保存。而提取得到的miRNAs，因其失去基團(tuán)的保護(hù)而變得容易降解，保存條件極為苛刻，因此需要及時(shí)選擇合適的方式保存。目前的方式有將miRNAs置于-70℃的無(wú)水乙醇里長(zhǎng)期保存，使用時(shí)離心沉淀；或者是現(xiàn)今普遍為大家接受的，將miRNAs逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再-20℃分裝保存，其中要注意miRNAs水解酶的去除，如加入DEPC；另外，還有一個(gè)高成本的保存模式，即利用RNA穩(wěn)定劑（RNA stable）［35-36］與提取得到的miRNAs混合，經(jīng)過(guò)干燥后，可長(zhǎng)期保存達(dá)12年之久。以上各保存方法用于臨床時(shí)，仍然需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以保證血清/血漿miRNAs在不同時(shí)間檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

2　總結(jié)

miRNAs與疾病相關(guān)［37］，現(xiàn)已利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)出非常多與疾病的診斷與治療相關(guān)的miRNAs標(biāo)志物。如miRNA-143在結(jié)直腸癌血漿樣本中低表達(dá)，研究推測(cè)其可能與提高結(jié)直腸癌患者對(duì)奧沙利鉑的敏感性以及阻止TLR2通路有關(guān)［38-39］。但是要將miRNAs RT-qPCR用于臨床存在很多需要解決的問(wèn)題。其一，血清/血漿中miRNAs含量極少，1 mL血的抽提總量可能只在ng或pg等級(jí)，這意味著在實(shí)施定量檢測(cè)時(shí)，血清/血漿miRNAs須從標(biāo)本采集開(kāi)始標(biāo)準(zhǔn)化，擬定最佳的miRNAs提取方案以及最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括最大化避免miRNAs降解，設(shè)計(jì)特異性莖環(huán)引物，以及擴(kuò)增效率不被抑制的qPCR等；其二，需進(jìn)行大規(guī)模的健康人群篩查，包括不同性別和年齡的血清/血漿表達(dá)譜信息，完善相關(guān)標(biāo)志物的腫瘤特異性，以及腫瘤患者個(gè)體間的異質(zhì)性，甚至是miRNAs表達(dá)的時(shí)空特異性；最后，標(biāo)準(zhǔn)化血清/血漿miRNAs RT-qPCR檢測(cè)的每一個(gè)細(xì)節(jié)，使其成為疾病診斷與預(yù)后判斷的有力工具。

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The preparation of real-time fluorescent quantitative PCR detection of serum/plasma microRNAs before clinical application

DENG Kaifeng，DAI Shengming★
（Liuzhou Key Laboratory of Tumor Diseases and Prevention，Clinical Laboratory，F(xiàn)ourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545005）

It has been proved that the changes of serum/plasma microRNAs（miRNAs）expression relates to the occurrence and development of various diseases.The molecular of serum/plasma miRNAs are stable and hard to degrade.It is easy to obtain blood specimen from small wound and suitable to detect for clinical laboratory.Therefore，miRNAs are most likely to become a potential biomarker for disease diagnosis and prognosis evaluation，even the target spot of treatment.As is easy to operate with few RNA，and with high sensitivity to detect a variety of miRNAs expression in a short time，real time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）detection method has a good application prospect.In this paper，a review on the detection methods of serum/plasma miRNAs with RT-qPCR at the present stage will be discussed，and the countermeasures on the clinical application of serum/plasma miRNAs quantitative detection will be summarized.

MicroRNAs；Serum/plasma；Real-time quantitative PCR

國(guó)家自然科學(xué)基金（81160269）

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，柳州市腫瘤疾病與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西，柳州545005

戴盛明，E-mail：daishm@sina.com