超聲誘導提取大豆中脂肪氧合酶的工藝研究

丁文武，孟麗，叢林娜，夏云空

（1.西華大學生物工程學院，四川成都610039；2.山東勝通集團股份有限公司，山東東營257500；3.中國科學院上海高等研究院，低碳轉(zhuǎn)化科學與工程重點實驗室，上海201210；4.四川大學生命科學學院，四川成都610065）

超聲誘導提取大豆中脂肪氧合酶的工藝研究

丁文武1，孟麗2，叢林娜3，夏云空4

（1.西華大學生物工程學院，四川成都610039；2.山東勝通集團股份有限公司，山東東營257500；3.中國科學院上海高等研究院，低碳轉(zhuǎn)化科學與工程重點實驗室，上海201210；4.四川大學生命科學學院，四川成都610065）

應用超聲誘導法對大豆中脂肪氧合酶進行了粗提，并考察了超聲溫度、時間和固液比對提取大豆中脂肪氧合酶的影響，并通過正交試驗進一步優(yōu)化實驗條件；結(jié)果表明，大豆中脂肪氧合酶提取單因素影響最佳工藝條件為超聲溫度35℃、時間25 min、固液比1∶25 g∶mL；正交實驗最佳工藝條件為超聲溫度30℃，時間30 min，固液比1∶30 g∶mL，此條件下所得酶活為4 033 U/mL，因此這種方法更簡單迅速，提取率也更高。

大豆；脂肪氧合酶；超聲波；提取

脂肪氧合酶屬氧化還原酶，通稱脂氧酶（LOX）［1］。LOX廣泛分布于各種植物中，在豆類中具有較高的活力，其中尤以大豆中活力最高［2］，許多研究結(jié)果表明LOX在植物生理，如植物萌發(fā)、生長、發(fā)育、衰老和抗性等物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起某種重要調(diào)節(jié)作用，可以運用于植物抗病、抗蟲和傷害反應［3］；脂肪氧合酶也可用于漂白含有類胡蘿卜素的植物或海洋食品物質(zhì)。這樣它可用于漂白制作面包、面條或意大利面食的面粉或者漂白含有蝦青素的魚肉或魚油，因此對LOX的研究和應用工作也正逐漸深入進行［4-7］。

酶的提取方法有很多，包括高速組織搗碎［8］、玻璃勻漿器勻漿［9］、反復凍融法［10］、化學處理法、超聲波處理法［11］等。其中超聲提取法是研究最為廣泛的一種。超聲提取是利用超聲波具有的機械效應，空化效應和熱效應，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、介質(zhì)的穿透力以提取生物有效成分［12］，在天然產(chǎn)物有效成分的提取過程中日益得到科研工作者們的充分重視［13-14］。

本試驗以大豆為原料，通過超聲誘導法提取大豆中脂肪氧合酶，尋找其提取的最佳工藝條件，一方面對脂肪氧合酶的酶學性質(zhì)研究提供幫助，同時也為大豆制品的研究和利用提供一定參考。

1材料和方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料

大豆：大潤發(fā)濟南歷下店；石油醚：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；無水乙醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；亞油酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；吐溫20：化學純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

酸度計：上海般特儀器制造有限公司；超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TG-16高速離心機：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 脫脂豆粉樣品的制備

大豆經(jīng)攪拌器打碎，用40目標準檢驗篩去皮，稱取一定質(zhì)量的大豆粉，用石油醚浸泡5次，其中固液比為1∶5（g∶mL），每次浸泡3 h，得到脫脂豆粉，然后于室溫下晾干并在4℃條件下保存?zhèn)溆茫?5］。

1.2.2 影響因素的測定

固液比影響：將不同固液比樣品于20℃下超聲15 min，離心后將所得上清液配成相同體積后測酶活；超聲時間影響：將一定固液比的樣品于20℃下超聲不同時間后，離心取上清液測酶活；超聲溫度影響：將一定固液比的樣品在不同溫度下超聲一定時間后，離心取上清液測酶活。

1.2.3 酶活測定

底物溶液的配制：將0.25 mL的TWeen20溶液分散于10 mL pH 9.0的硼酸鹽緩沖溶液中，搖動下逐滴加入0.27 mL亞油酸，然后向體系中加入一定濃度的NaOH溶液使其澄清，再用HCl溶液將體系pH調(diào)至9.0，最后把上述溶液用pH 9.0緩沖液定容到500 mL，保存?zhèn)溆茫?5-16］。

酶活測定：將0.2 mL粗酶液加入到1.5 mL底物溶液中，混勻后于25℃恒溫水浴鍋中恒溫反應3 min，再向體系中先后各加入5 mL無水乙醇和水，混勻后用分光光度計在234 nm處測定反應液的吸光度［15］；空白試驗為加入粗酶液和無水乙醇后，再加入底物溶液，其余操作與反應樣品操作相同；酶活的計算是以1 min內(nèi)反應體系的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位［15］。

2結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 固液比對提取酶活的影響

固液比對提取酶活的影響如圖1所示。

圖1 固液比對提取酶活的影響Fig.1Effect of solid-to-liquid ratio of ultrasonic treatment on enzyme activity

由圖1可知隨著液固比的增大，酶活先增大后減小，這是由于隨著液固比的增大，酶加入量相對減少，溶液較稀薄，則原料顆粒被破碎的機會越大，提升了超聲波的效果，有利于酶的溶出；但是當液固比超過一定比例后，細胞內(nèi)外的滲透壓減小，酶的溶出速度減慢，酶的提取活性降低［14］。因此確定最佳固液比為1∶25。

2.1.2超聲時間對提取酶活的影響

超聲時間對提取酶活的影響如圖2所示。

圖2 超聲時間對提取酶活的影響Fig.2Effect of time of ultrasonic treatment on enzyme activity

由圖2可知，酶活隨著超聲時間的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，其最佳超聲時間出現(xiàn)在25 min左右。這可能是由于超聲開始的一段時間里，隨著超聲時間的延長，形成的氣泡越多，高頻振蕩越劇烈，吸收的聲能越大，破壁的效果越好，因而酶的溶出量就越多［17］；但是由于超聲的強烈震蕩及熱效應的作用會導致酶活力下降，并且細胞內(nèi)大量不溶物及較多的粘液混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多黏度增大，從而增大了傳質(zhì)阻力影響酶的溶出，因而超聲時間亦不能過長。

2.1.3 超聲溫度對提取酶活的影響

圖3顯示的是超聲溫度對提取酶活的影響。

圖3 超聲溫度對提取酶活的影響Fig.3Effect of temperature of ultrasonic treatment on enzyme activity

如圖所示，當溫度為35℃左右時，經(jīng)超聲處理的酶活性最大，而低于35℃或高于35℃時，均表現(xiàn)為酶活的下降，因此最佳超聲溫度在35℃左右。這可能是由于溫度偏低，酶的活性較低；而超過一定溫度后，則會破壞酶的空間構(gòu)象［18］，造成酶的活性成分被破壞，使酶的活性降低，同時使雜質(zhì)的溶出量增加，也阻礙了酶促反應的進程，降低了反應速率。

2.2 正交試驗

由單因素所做結(jié)果，選出最佳數(shù)據(jù)，根據(jù)正交組合的原則，每個因素選出由最佳數(shù)據(jù)組成的三個水平，組成四因素三水平的正交表，如表1所示。

表1 正交試驗結(jié)果與分析Table 1Results and analysis of thogonal test

由表1可知，3個因素對提取效果的影響主次順序為：超聲溫度＞超聲時間＞固液比，因此正交實驗的最佳條件是溫度30℃、時間30 min、固液比1∶30；對正交優(yōu)化后所選擇的工藝條件進行了驗證（見表2所示），結(jié)果表明：此條件下所得酶活為4 033 U/mL。

表2 正交試驗的最佳工藝條件測定結(jié)果Table 2Results of optimum condition from thogonal test

3結(jié)論

應用超聲誘導法對大豆中脂肪氧合酶進行了粗提，考察了超聲溫度、時間和固液比對提取大豆中脂肪氧合酶的影響，并進行了正交試驗以得到最佳提取工藝條件；單因素影響最佳工藝條件為超聲溫度35℃、時間25 min、固液比1∶25（g∶mL）；正交試驗最佳工藝條件為超聲溫度30℃，時間30min，固液比1∶30（g∶mL），此條件下所得酶活為4 033 U/mL，因此這種方法更簡單迅速，提取率也更高。

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Extraction of Lipoxygenase from Soybean by Ultrasonic Treatment

DING Wen-wu1，MENG Li2，CONG Lin-na3，XIA Yun-kong4
（1.School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China；2.Shan Dong Sntion Group Co.，Ltd.，Dongying 257500，Shandong，China；3.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；4.College of life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China）

The influence factors including extraction temperature，time and solid-to-liquid ratio were studied by single factor test and orthogonal test to obtain the optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean by ultrasonic Treatment.The optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean，determined by single factor test，were as follows：extraction temperature 35℃，time 25 min and solid-to-liquid ratio 1∶25 g∶mL. On the basis of the single factor test，orthogonal test was carried out and the results showed that the optimum conditions were extraction temperature 30℃，time 30 min and solid-to-liquid ratio 1∶30 g∶mL，on which the enzyme activity was 4 033 U/mL.It was simple and fast to extract lipoxygenase in soybean by ultrasonic treatment，and the exaction rate was also higher.

soybean；lipoxygenase；ultrasonic wave；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.014

2014-08-19

四川省教育廳一般項目（15ZB0126）；西華大學2014年校重點科研基金項目（z1420523）

丁文武（1980—），男（漢），講師，博士，研究方向：酶的提取和應用。