比色法快速測(cè)定γ-氨基丁酸含量

趙國(guó)群，王維

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

比色法快速測(cè)定γ-氨基丁酸含量

趙國(guó)群，王維

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

當(dāng)有乙醛酸、琥珀酸存在時(shí)，γ-氨基丁酸（GABA）與溴甲酚綠發(fā)生專(zhuān)一的、特殊的顯色反應(yīng)?；谶@一顯色反應(yīng)，建立了一種新的快速測(cè)定GABA含量的比色法。顯色劑中溴甲酚綠、琥珀酸和乙醛酸溶液的適宜濃度分別為0.5、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL。測(cè)定GABA含量的適宜條件為：4 mL樣品溶液，加入2 mL顯色劑，混合搖勻，在25℃下水浴5 min，于617 nm測(cè)定吸光值。其它氨基酸如谷氨酸對(duì)GABA測(cè)定有一定的影響。

γ-氨基丁酸；比色法；溴甲酚綠

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)的天然氨基酸，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，大多由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧產(chǎn)生的［1］。GABA具有降血壓、改善肝功能、調(diào)節(jié)激素分泌、改善睡眠、增強(qiáng)記憶力、抗衰老、防治肥胖等重要生理作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域［2-3］。GABA的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法［4］。

目前GABA的檢測(cè)方法有很多，主要有液相色譜法［5-6］、氨基酸分析儀法［7］、毛細(xì)管電泳法［8］、紙上電泳法［9］、酶聯(lián)熒光法［10］、放射性免疫法［11］等，但以上方法大多前處理過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，不宜用于大批量樣品的定量分析。陳恩成等基于Berthelot顯色反應(yīng)，研究出了使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)快速測(cè)定GABA的比色法［12］，但這種方法對(duì)操作過(guò)程要求高，使用非環(huán)境友好型試劑苯酚和次氯酸鈉等，且檢測(cè)時(shí)間仍較長(zhǎng)。

黃麗華等［13］在篩選高產(chǎn)GABA的酵母菌株時(shí)，使用了一種含有溴甲酚綠的篩選培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基對(duì)GABA具有顯色專(zhuān)一性，從而可快速地初篩出GABA高產(chǎn)菌株。本文在此基礎(chǔ)上，研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定GABA的分光光度比色法。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

GABA：美國(guó)Sigma公司；溴甲酚綠：天津市百世化工有限公司；琥珀酸：天津市博迪化工有限公司；50%乙醛酸：上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

SP-752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1篩選培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基+0.01%溴甲酚綠+0.2%乙醛酸+ 0.2%琥珀酸［13］。

1.2.2顯色劑的配制

分別用去離子水配制0.5 mg/mL溴甲酚綠、4.0 mg/mL琥珀酸和6.0mg/mL乙醛酸溶液，將以上3種溶液按照1∶1∶1的比例混合均勻，即制成顯色劑。

1.2.3GABA比色法檢測(cè)的可行性研究

用去離子水分別配制濃度為10 mg/mL的檸檬酸、草酸、乳酸、鹽酸、硫酸、磷酸和GABA溶液20 mL。然后，依次將上述酸溶液滴加在篩選培養(yǎng)基上，觀察其顯色情況。分別用去離子水配制濃度1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL和9.0 mg/mL GABA溶液，取4.0 mL加入比色管中，然后加入2.0 mL顯色劑，混勻，靜置，觀察其色澤變化。

1.2.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

吸取6.0mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0mL，加入2.0mL顯色劑，混合均勻，靜置5 min后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上對(duì)該溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

1.2.5顯色條件的影響

1.2.5.1反應(yīng)溫度的影響

吸取6.0mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0mL，加入2.0mL顯色劑，混合均勻。分別在15、20、25、30、35、40、45、50℃下水浴5 min，于617 nm測(cè)定吸光值。

1.2.5.2溴甲酚綠濃度的影響

分別配制0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL和0.9 mg/mL溴甲酚綠溶液，并與4.0 mg/mL琥珀酸和6.0 mg/mL乙醛酸，按照1∶1∶1配成顯色劑。吸取6.0 mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0 mL，加入2.0 mL上述顯色劑，混合均勻，室溫（約25℃）下靜置5 min，于617 nm測(cè)定吸光值。

1.2.5.3琥珀酸、乙醛酸濃度的影響

分別配制1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL琥珀酸/乙醛酸溶液，并與0.5 mg/mL溴甲酚綠和6.0 mg/mL乙醛酸/4.0 mg/mL琥珀酸溶液，按照1∶1∶1配成顯色劑。其它操作同1.2.5.2。

1.2.6顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取6.0 mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0 mL，與2.0 mL顯色劑混合。然后，在25℃下水浴，于617nm每隔5分鐘測(cè)定一次吸光值，共12次。

1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確吸取1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL和9.0 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0 mL，加入2.0 mL顯色劑，混合搖勻，在25℃下水浴5 min，于617 nm測(cè)定吸光值。

1.2.8其他氨基酸對(duì)GABA測(cè)定的影響

分別配制甘氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸和組氨酸4.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取2.0 mL分別與2.0mL4.0mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，再加入2.0mL顯色劑，混合搖勻，25℃水浴5 min，于617 nm測(cè)定吸光值。同時(shí)測(cè)定2.0 mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值。

1.2.9精密度實(shí)驗(yàn)

精確吸取4.0 mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.7方法進(jìn)行同樣操作，測(cè)定吸光值。

1.2.10回收率實(shí)驗(yàn)

分別精確吸取5.0 mL 2.0 mg/mL和6.0 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入5.0 mL 4.0 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，按1.2.7方法進(jìn)行測(cè)定，分別重復(fù)試驗(yàn)3次。

2結(jié)果與討論

2.1GABA比色法檢測(cè)的可行性

溴甲酚綠是一種常用的酸堿指示劑，pH=3.8時(shí)呈黃色，pH=5.4時(shí)呈藍(lán)綠色，其顏色變化能靈敏的指示溶液中酸度的變化［14］。黃麗華等［13］在篩選高產(chǎn)GABA酵母菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溴甲酚綠與乙醛酸、琥珀酸共存時(shí)，對(duì)GABA具有顯色專(zhuān)一性。為了驗(yàn)證其顯色專(zhuān)一性，試驗(yàn)了6種常見(jiàn)酸，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　GABA與其它酸在篩選培養(yǎng)基上的顯色Fig.1The chromogenic results of GABA and other acids in the screening cultural medium

從圖1中可以清楚地看出，檸檬酸、草酸、乳酸、鹽酸、硫酸、磷酸溶液在篩選培養(yǎng)基上均不顯色，只有GABA顯示出黃綠色。當(dāng)將GABA溶液與溴甲酚綠溶液混合時(shí)，反應(yīng)液呈深藍(lán)色（結(jié)果未顯示）。這個(gè)結(jié)果表明，當(dāng)有乙醛酸、琥珀酸存在時(shí)，常見(jiàn)的有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸不再使得溴甲酚綠變色；而溴甲酚綠卻可與GABA發(fā)生專(zhuān)一的、特殊的顯色反應(yīng)，但其反應(yīng)機(jī)理和成色物質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚不清楚，可能是形成了復(fù)合物。討論，是否可利用這種專(zhuān)一的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)GABA呢？不同濃度GABA的顯色效果見(jiàn)2。

圖2　不同濃度GABA的顯色效果Fig.2The chromogenic result of GABA in different concentrations

隨著GABA濃度的增加，GABA溶液的色澤由淺黃轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠、綠色，而且綠色越來(lái)越深。因此，初步判斷采用比色法定量檢測(cè)GABA是可行的。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將GABA與顯色劑混合顯色后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，對(duì)GABA顯色液于500 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　GABA顯色液的掃描曲線Fig.3Scanning curve of GABA chromogenic solution

由圖3可以看出，顯色液在617 nm處有最大吸收峰，因此，選擇617 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3顯色條件對(duì)顯色反應(yīng)的影響

2.3.1反應(yīng)溫度的影響

溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4　溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.4Effect of temperature on the chromogenic reaction

從圖4可以看出，當(dāng)溫度在15℃～25℃時(shí)，反應(yīng)溫度對(duì)顯色反應(yīng)后溶液的吸光度幾乎沒(méi)有影響。當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)25℃時(shí)，隨著溫度的升高，顯色液吸光度逐漸減小。因此，適宜的反應(yīng)溫度為25℃。

2.3.2溴甲酚綠濃度的影響

溴甲酚綠濃度的影響見(jiàn)圖5。

圖5　溴甲酚綠濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.5Effect of bromcresol green's concentration on the chromogenic reaction

如圖5所示，隨著顯示劑中溴甲酚綠濃度的升高，反應(yīng)液的吸光值幾乎呈線性增加。從1.2.3實(shí)驗(yàn)可知，乙醛酸和琥珀酸的存在才使得溴甲酚綠可與GABA發(fā)生專(zhuān)一的顯色反應(yīng)，那么，乙醛酸、琥珀酸應(yīng)與溴甲酚綠存在一定比例關(guān)系。如果溴甲酚綠的濃度過(guò)高，會(huì)造成顯色劑中只有部分溴甲酚綠與GABA發(fā)生專(zhuān)一的顯色反應(yīng)，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，顯色劑中溴甲酚綠濃度的選擇不能僅以吸光度的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.3.3琥珀酸、乙醛酸濃度的影響

分別調(diào)整顯色劑中琥珀酸、乙醛酸的濃度，然后與6.0 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液混合顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　琥珀酸、乙醛酸濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.6Effect of glyoxylic acid’s and succinic acid’s concentrations on the chromogenic reaction

從圖6可以發(fā)現(xiàn)，隨著顯色劑中琥珀酸、乙醛酸濃度的增加，顯色反應(yīng)后溶液的吸光度均逐漸減小。在同樣GABA濃度下，較高的乙醛酸濃度會(huì)使得反應(yīng)液色澤變淺，吸光值變小。在GABA與溴甲酚綠的特殊顯色反應(yīng)中，琥珀酸、乙醛酸、溴甲酚綠和GABA會(huì)存在一定的比例關(guān)系。降低顯示劑中琥珀酸、乙醛酸的濃度可提高反應(yīng)液的吸光度，但二者濃度過(guò)低時(shí)，會(huì)影響GABA與溴甲酚綠的特殊顯色反應(yīng)，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。故此，顯色劑中琥珀酸、乙醛酸濃度的選擇也不能僅以吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

以GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2及吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)多次試驗(yàn)，最終確定溴甲酚綠、琥珀酸、乙醛酸溶液的最佳濃度分別為0.5、4.0、6.0 mg/mL。

2.4顯色穩(wěn)定性

顯色穩(wěn)定性是比色法檢測(cè)的一個(gè)重要的參數(shù)。GABA溶液與顯色劑混合后，在25℃下水浴1 h，每隔5分鐘測(cè)定一次吸光度，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　GABA反應(yīng)液1h顯色穩(wěn)定性（n=12）Table 1The colour stability of GABA reaction solution in 1 h（n=12）

在1 h放置時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)液吸光度的變化很小，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.21%，這說(shuō)明顯色非常穩(wěn)定。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確配制不同濃度GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法測(cè)定其617 nm處的吸光值。以GABA濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光值為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行做圖，GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7。

圖7　GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7Standard curve of GABA

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A= 0.126 8C－0.026 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 8。待測(cè)液中GABA濃度在0～9.00 mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度的相關(guān)性較好。基于Berthelot顯色反應(yīng)，陳恩成等［12］、孫波等［15］研究了快速測(cè)定糙米、酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中GABA含量的比色法，其GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2達(dá)到了0.999，GABA檢測(cè)范圍為0～1.00 mg/mL，即Berthelot比色法的檢測(cè)準(zhǔn)確度優(yōu)于本法，其檢測(cè)下限也遠(yuǎn)低于本法。但是，本法操作更簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度也更快，非環(huán)境友好型試劑的使用更少。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA主要是利用乳酸菌來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其GABA產(chǎn)量一般較高?？姶嬗暗龋?6］從酸菜中分離篩選出了高產(chǎn)GABA乳酸菌，其發(fā)酵液中GABA含量可達(dá)13.4 mg/mL。張術(shù)聰?shù)龋?7］以L-谷氨酸為底物，利用植物乳桿菌全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液中GABA濃度達(dá)到140 mg/mL。因此，本法非常適合應(yīng)用于GABA的工業(yè)發(fā)酵及GABA的發(fā)酵工藝研究等科研工作，可很簡(jiǎn)便地來(lái)分析和監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的GABA含量。

2.6其他氨基酸對(duì)GABA測(cè)定的影響

選取甘氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸和組氨酸作為代表，研究了6種氨基酸對(duì)GABA測(cè)定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8　其他氨基酸對(duì)GABA測(cè)定的影響Fig.8Effect of other amino acids on determination of GABA

從圖8中可以發(fā)現(xiàn)，其他氨基酸對(duì)GABA含量的測(cè)定有一定的影響。以2 mg/mLGABA吸光度作為對(duì)照，甘氨酸、賴(lài)氨酸、色氨酸、丙氨酸和組氨酸的存在會(huì)使得GABA測(cè)定值偏高，而谷氨酸的存在會(huì)使得GABA測(cè)定值偏低。在本實(shí)驗(yàn)條件下，色氨酸使得GABA吸光值增高3.2%；甘氨酸、賴(lài)氨酸、丙氨酸和組氨酸使得GABA吸光值增高在10%～15.2%；谷氨酸使得GABA吸光值降低13.5%。當(dāng)然，在實(shí)際的測(cè)定中，其他共存氨基酸的影響大小還取決于具體的測(cè)定環(huán)境。盡管其他氨基酸對(duì)GABA測(cè)定有一定的干擾，但本法仍不失為一種非常簡(jiǎn)便的測(cè)定方法，尤其是對(duì)于GABA工業(yè)發(fā)酵以及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的GABA發(fā)酵工藝研究，GABA測(cè)定的精確度要求不高或可以降低測(cè)定精確度要求，很適合采用本法測(cè)定GABA的含量。

2.7精密度實(shí)驗(yàn)

精確吸取4.0 mg/mLGABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次，在617 nm處的吸光值分別為0.322、0.326、0.321、0.319、0.322、0.318，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.88%，RSD遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于5%，表明本方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.8回收率實(shí)驗(yàn)

按照1.2.10的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of recovery test

如表2所示，加樣平均回收率為95.33%，平均RSD為1.26%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確性較好。

3結(jié)論

當(dāng)有乙醛酸、琥珀酸存在時(shí)，GABA與溴甲酚綠發(fā)生專(zhuān)一的、特殊的顯色反應(yīng)。反應(yīng)液在617 nm處有最大吸收峰。隨著GABA濃度的增加，反應(yīng)液的綠色越來(lái)越深?；谏鲜鲲@色反應(yīng)，建立了一種可簡(jiǎn)便、快速測(cè)定GABA含量的新比色法。組成顯色劑的溴甲酚綠、琥珀酸和乙醛酸溶液的適宜濃度分別為0.5、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL。將以上3種溶液按照1∶1∶1的比例混合均勻，即制成顯色劑。適宜的顯色條件為：4 mL樣品溶液，加入2 mL顯色劑，混合搖勻，在25℃下水浴5min。GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=0.126 8C－0.026 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 8。本檢測(cè)方法的精密度（重復(fù)測(cè)定樣品的RSD）為0.88%，平均回收率為95.33%，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性較好。其它氨基酸如谷氨酸對(duì)GABA的測(cè)定結(jié)果有一定的影響。本方法的精確度略低于Berthelot比色法，檢測(cè)下限也遠(yuǎn)高于Berthelot比色法。但是，本方法操作更簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間更短、檢測(cè)成本更低，非常適合大批量樣品如GABA發(fā)酵液的快速檢測(cè)。

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A Rapid Colorimetric Method for Determination of γ-Aminobutyric Acid

ZHAO Guo-qun，WANG Wei
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

γ-aminobutyric acid（GABA）had a unique reaction with bromcresol green when glyoxylic acid and succinic acid were present with them.A new colorimetric method for rapid determination of GABA was developed based on the reaction above.The optimal concentrations of bromcresol green，glyoxylic acid and succinic acid in the chromogenic agent were 0.5，4.0 mg/mL and 6.0 mg/mL respectively.The optimal condition for determination of GABA was that 4 mL sample was mixed with 2 mL chromogenic agent，and the absorbance of the mixed solution was determined in a spectrophotometer at 617 nm after it was kept in a water bath at 25℃for 5 min.It was found that other amino acids such as glutamate acid had some disturbance.

γ-Aminobutyric acid；colorimetric method；bromcresol green

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.024

2014-04-12

趙國(guó)群（1963—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。