芽孢桿菌彈性蛋白酶基因的克隆、表達及其大豆肽的制備能力鑒定

宋　笛，劉艷芝（.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春30033；2.吉林省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林長春30033）

芽孢桿菌彈性蛋白酶基因的克隆、表達及其大豆肽的制備能力鑒定

宋笛1，劉艷芝2，*
（1.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130033；2.吉林省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林長春130033）

從芽孢桿菌中克隆得到彈性蛋白酶并命名為TX1，并連入pEAZY E1載體，構(gòu)建了原核表達載體pEAZY E1-TX1。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)基因表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化后通過pH-stat測定其制備大豆肽的水解能力。序列分析結(jié)果表明TX1基因長度為1143bp，與Genbank上已報道序列（JQ305692.1）同源性最高為99.48%，產(chǎn)生的堿基突變不影響其氨基酸編碼。蛋白表達分析結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.3mmol·L-1，誘導(dǎo)4h蛋白表達量最高。經(jīng)SDS-PAGE和Western分析結(jié)果表明，經(jīng)Ni離子親和層析純化獲得量大小為39.4ku的彈性蛋白酶His-TX1。初步確定其在50℃、pH為7.4反應(yīng)4h時的大豆肽水解率最高，達到14.51%。

芽孢桿菌，彈性蛋白酶，克隆，大豆肽

盡管豆粕中含有豐富的蛋白質(zhì)，但是作為大豆食用油生產(chǎn)的副產(chǎn)品，目前仍主要作為動物飼料使用。然而，通過蛋白酶消化、微生物發(fā)酵結(jié)合其他物理化學(xué)手段處理，可以將大豆和豆粕中的分子量較大的蛋白質(zhì)降解為具有良好熱穩(wěn)定性、水溶性、乳化性、抗凝膠性、低粘度等理化性質(zhì)的低分子活性肽（分子量＜1000u），即大豆肽。研究表明［1-2］大豆肽含有豐富的必須氨基酸、且非常利于人體吸收，除了能夠作為食品添加劑改善食物口感，還能通過調(diào)節(jié)“負氮平衡”有效地緩解機體的缺氧、提高機體免疫力［3-5］，并能夠通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性，控制高血壓的形成［6-8］。

目前生產(chǎn)大豆肽的主要工業(yè)手段是微生物發(fā)酵法和蛋白酶消化法［9-10］。盡管微生物法廉價且高效，但存在較為嚴(yán)重的安全問題，很多優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生有毒的或是有害的副產(chǎn)物［11］。通過現(xiàn)代生物技術(shù)從微生物基因組中克隆具有良好理化性質(zhì)的蛋白酶并在大腸桿菌、酵母以及動植物細胞體內(nèi)實現(xiàn)表達，對推動以大豆和豆粕為原料生產(chǎn)大豆肽具有十分重要的意義。

在以往的研究中，研究者大多選擇木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等具有極高蛋白水解能力的蛋白酶，本研究選擇在對豆粕水解釋放大豆肽的同時盡可能避免產(chǎn)生苦味蛋白，并以能夠提高食物口感的彈性蛋白酶［12］作為研究對象，通過PCR技術(shù)從枯草芽孢桿菌基因組中成功克隆了彈性蛋白酶基因TX1，并構(gòu)建了pEAZY E1-TX1原核表達載體，通過IPTG誘導(dǎo)實現(xiàn)了彈性蛋白酶的原核表達，并初步測定了其對豆粕的降解能力，為進一步利用該彈性蛋白酶進行大豆肽的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌種EL31410購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞Trans1-T1、BL21、原核表達載體pEASY-E1 Expression Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細菌基因組提取試劑盒酶天根生化科技（北京）有限公司；EasyPfu DNA Polymerase酶北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒寶生物工程（大連）有限公司；ProteinFind Anti-His Mouse Monoclonal Antibody北京全式金生物技術(shù)有限公司；超敏快速Western試劑盒海基生物有限公司；豆粕購自遼寧愛普羅斯飼料有限公司；其他化學(xué)試劑如無水乙醇、氯仿、苯酚等為國藥分析純。

梯度PCR儀購自東勝隆生物技術(shù)有限公司；超凈工作臺、水平電泳儀、垂直電泳儀購自美國伯樂生物有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1彈性蛋白酶基因TX1的克隆及表達載體的構(gòu)建使用細菌基因組提取試劑盒提取芽孢桿菌EL31410的基因組DNA并稀釋至50ng/μL作為模板，根據(jù)GenBank中芽孢桿菌彈性蛋白酶基因（GenBank：JQ305692.1）序列設(shè)計引物TXF（5’-ATGAGAAGCAA AAAATTGTGGATCAGC-3’）和TXR（5’-TTATTGTG CAGCTGCTTGTACGTTGA-3’），利用PCR法擴增目的片段。PCR反應(yīng)使用EasyPfu DNA Polymerase酶并按照其說明書進行擴增，PCR程序為：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃后延伸5min。

按照pEASY-E1 Expression Kit說明書將PCR產(chǎn)物連接到表達載體pEASY-E1上轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1，將經(jīng)鑒定的重組子交由上海杰瑞基因有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank上已發(fā)布的序列進行比對。并將序列插入方向正確的克隆命名為pEASY E1-TX1。提取該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌BL21感受態(tài)細胞。

1.2.2TX1基因的表達條件優(yōu)化將攜帶原核表達載體pEASY E1-TX1的工程菌BL21細胞在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD值0.6時，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6mmol·L-1的IPTG，28℃誘導(dǎo)4h，并通過12%的SDS電泳分析IPTG濃度對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。并在加入0.3mmol·L-1的IPTG條件下誘導(dǎo)0、2、4、6h，分析不同誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。

1.2.3目的蛋白的純化回收將經(jīng)0.3mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)4h的菌液離心收集菌體，并用0.1倍體積的PBS緩沖液重懸菌體，400W超聲波破碎5s間隔10s，共計20個循環(huán)。15000g離心5min收集上清并利用Ni柱純化目的蛋白。通過12%的SDS電泳分析純化效果，并將純化后的蛋白經(jīng)10%的SDS電泳后于半干轉(zhuǎn)膜儀中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并利用商業(yè)化的His抗體進行Western雜交分析。

1.2.4彈性蛋白酶活性分析分別稱取500mg豆粕粉末加入5mL不同pH（3.6、5.6、7.4、9.0、9.5、10.6）的0.2mmol·L-1的緩沖液（pH3.6乙酸-乙酸鈉，pH5.6磷酸鈉，pH7.4～9.0的硼酸-硼酸鈉，pH9.5～10.6的碳酸鈉）中，并向其中依次添加10mg經(jīng)純化的彈性蛋白酶，在50℃條件下反應(yīng)4h，并利用優(yōu)化的pH-stat法［13］測定彈性蛋白酶對豆粕的水解度。在pH7.4的硼酸-硼酸鈉緩沖液中不同溫度（4、25、37、42、50、65、70℃）條件下4h消化處理后，測定該彈性蛋白酶對豆粕的水解度。

水解度（%）=（堿的消耗量×堿的摩爾濃度）/（大豆分離蛋白氨基的平均解離度×被水解蛋白的質(zhì)量×每克蛋白底物具有肽鍵的物質(zhì)量）×100

2　實驗結(jié)果

2.1彈性蛋白酶基因TX1的克隆與原核表達載體構(gòu)建

如圖1所示，通過PCR成功獲得與目的基因大小相符的DNA片段。將該片段連接到原核表達載體pEASY E1并進行測序發(fā)現(xiàn)，該序列全長1320bp，包含一個1143bp的閱讀框，編碼由380個氨基酸構(gòu)成的彈性蛋白酶，和一個177bp的3’非翻譯區(qū)序列。編碼區(qū)與已發(fā)表的序列（GenBank：JQ305692.1）進行比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同源性為99.48%，共計出現(xiàn)6個堿基差異，其中第327位（C→G）、393位（C→A）、420位（T→A）、541位（C→A）、582位（C→A）、1032位（A→T）均不影響氨基酸的編碼。選擇目的基因片段正確插入到原核表達載體pEASY E1的重組子，即T7啟動子→SD序列→TX1基因→T7終止子的重組子命名為pEASYE1-TX1。

圖1　彈性蛋白酶基因TX1的克隆與原核表達載體構(gòu)建Fig.1　The Cloning of Elastase gene named TX1 and the construction of recombinant expression plasmid

2.2TX1基因的表達條件優(yōu)化

通過對不同誘導(dǎo)條件的比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入IPTG濃度為0.3mmol·L-1時，39.4ku處的目的蛋白表達量不再增加（圖2B）；而當(dāng)誘導(dǎo)時間達到4h以后目的基因的蛋白表達量也沒有明顯變化（圖2A）。可以推斷最佳誘導(dǎo)條件為28℃條件下，0.3mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)4h。

圖2SDS-PAGE檢測His-TX1的表達Fig.2　The expression of His-TX1 detected with SDS-PAGE

2.3目的蛋白的純化回收

如圖3所示，SDS-PAG結(jié)果表明，經(jīng)Ni柱純化的洗脫液中僅含有一條分子量大小為39.4ku的蛋白條帶。Western雜交結(jié)果進一步證明了洗脫液中的蛋白條帶為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的彈性蛋白酶His-TX1。

圖3　融合蛋白His-TX1的純化與鑒定Fig.3　Purification and analysis of His-TX1 fusion proteins

2.4彈性蛋白酶活性分析

經(jīng)測定純化后的彈性蛋白酶His-TX1在pH3.6～10.6之間均能夠水解豆粕，且pH5.6～9.0之間其水解度高于10%，而在溫度37～65℃范圍同樣能夠達到10%以上，因此該蛋白酶能夠在較寬泛的溫度和pH范圍內(nèi)使用。通過對不同條件下豆粕為底物的水解度曲線分析確定，當(dāng)50℃，pH7.4時，該彈性蛋白酶活力最高，其對豆粕的水解度為14.51%。

圖4　不同處理對水解度的影響Fig.4　The effect of different treatments on protein hydrolysis

3　結(jié)論與討論

本研究成功的通過PCR法克隆了枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶TX1基因，通過IPTG誘導(dǎo)表達并純化了重組彈性蛋白酶His-TX1，經(jīng)實驗證實其在最適條件（50℃，pH7.4）下其對豆粕的水解度為14.51%，適合進行工業(yè)化生產(chǎn)大豆肽的要求。并且發(fā)現(xiàn)其在pH5.6～9.0，溫度范圍37～65℃，對100mg/mL的豆粕為原料進行大豆肽水解均可獲得10%以上的水解度，適合作為工程酶進行大豆肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

郭玉華等［12］研究表明，與傳統(tǒng)使用的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等不同，彈性蛋白酶不易造成過分水解所導(dǎo)致的食物口感下降和苦味物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，編碼彈性蛋白酶的TX1基因的克隆與表達及其進行對豆粕水解條件的測定，為無需脫苦處理的大豆肽生產(chǎn)提供了幫助，為以單純獲得更高的底物（大豆、豆粕）水解度為目標(biāo)的研究轉(zhuǎn)變?yōu)榧骖櫵猱a(chǎn)物口味的研究提供了基礎(chǔ)，為推動豆粕水解的大豆肽單純的作為動物食料轉(zhuǎn)向發(fā)展新的食品原料提供了新的思路。

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Cloning and expression of the elastase gene Bacillus subtilis and identification of the ability of preparation of soybean peptide

SONG Di1，LIU Yan-zhi2，*
（1.Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun 130033，China；2.Agro-Biotechnology Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

A elastase gene named TX1 was isolated from the genomic DNA of Bacillus subtilis by PCR amplification，and constructed into pEAZY E1 vector to generate a recombinant expression plasmid pEAZY E1-TX1.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21.The expression was induced by IPTG and the fusion protein His-TX1 was purified by Ni-NTA.The ability of the purified expression of hydrolysis of Soybean Peptide was identified by pH-stat method.The sequence analysis suggested that TX1 gene was cloned with a length of 1143bp，had 99.48%homology with the Elastase gene（JQ305692.1）published in the GenBank，and the mutants would not infected the sequence of the amimo acids encoded.The analysis of expression showed that the highest expression level was obtained with 0.3mmol·L-1IPTG at 28℃ for 4h.The SDS-PAGE and Western blotting analysis showed that fusion protein which was 39.4ku purified with nickel-nitrilotriacetic acid（Ni-NTA）metal-affinity chromatography matrices was the Elastase His-TX1.The highest hydrolysis activity of HIS-TX1 was detected at 50℃，pH7.4 for 4h，the hydrolysis reached 14.51%.

Bacillus subtilis；elastase；cloning；soybean peptide

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0235-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.042

2014－04－10

宋笛（1982-），碩士研究生，講師，主要從事生物技術(shù)與生物工程領(lǐng)域方面的研究。

劉艷芝（1964-），碩士研究生，副研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物方面的研究。

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20125097）。