鎘對水芹幼苗生理指標及葉綠體超微結構的影響

張靜　任君等

摘 要：在水培條件下，研究不同濃度Cd2+脅迫對水芹幼苗葉綠素含量、葉綠體超微結構、抗氧化系統(tǒng)等生理指標的影響。結果表明，高濃度Cd2+脅迫下，水芹幼苗葉片的葉綠體結構有明顯損傷，當Cd2+濃度達到2、5mg·L-1時超微結構顯示，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積增大，基質片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；當Cd2+濃度達到10mg·L-1時，基粒片層扭曲、變形、松散，基質稀薄。與對照組相比，Cd2+濃度為2、5mg·L-1時，葉綠素總量和葉綠素a含量均顯著下降。隨著Cd2+濃度逐漸增高，水芹葉片中MDA、H2O2、[O-2·]含量均顯著上升，SOD與 Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關系，而POD、CAT活性在整個濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。

關鍵詞：鎘；水芹幼苗；葉綠體超微結構；抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號 Q945.78 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-28-04

Effects of Cadmium on Physiological Indexes and Ultrastructure in Chloroplast in Cress Seedlings

Zhang Jing et al.

（Fisheries Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China ）

Abstract：The effects of different concentrations of Cd2+ on cress seedlings chlorophyll contents，ultrastrucure in chloroplast and antioxidative system were investigated using water culture method.The results indicated that chloroplast structure under high concentration of Cd2+ on cress seedlings have significant damage，membrane of chloroplast became foggy at 2 and 5mg·L-1 Cd2+，chloroplast vacuolated apparently，the slices of basal granule and thylakoids reduced，the slices of basal granule were distorted or even disintegrated，matrix was tenuous 10mg·L-1 Cd2+. Compared with the control，total chlorophyll and chlorophyll a levels significantly decreased at 10 mg·L-1 Cd2+. With increase in the concentration of Cd2+ the levels of MDA、H2O2、O2·- in cress seedlings significantly increased，SOD activity and concentration of Cd2+showed an inverse relationship，however POD and CAT activity increased and then decreased after.

Key words：Cadmium；Cress seedling；Ultrastructure in chloroplast；Antioxidative system

水芹（Oenanthe stolonifera D.C.）屬于傘形科、水芹菜屬多年水生宿根草本植物，是水生蔬菜的一種，在我國分布廣泛，常分布在河溝水田旁，具有耐寒、喜水、適宜短日照季節(jié)生長的特性。自然生長的水芹能夠在污水溝渠旁生長并且長勢旺盛，表明它有極強吸收N、P的能力，同時很多研究表明水芹對重金屬有一定的富集、吸附作用。申華[1]等人對水芹等3種水草對鎘污染水體的修復作用試驗中得出，在Cd2+10mg/L的高濃度下處理14d后水芹中鎘的富集量達到92.98mg/kg，華大春[2]等人對土培水芹不同器官中的鎘富集特性作了研究，結果表明低濃度Cd2+對水芹的生物量有一定的促進增長作用。現(xiàn)今相關研究多集中在水芹對重金屬鎘的富集吸收作用，而鎘對水芹的生理毒害特性鮮有報道。為此，本文通過研究在不同濃度外源Cd2+脅迫下水芹幼苗的相關生理特性，探究Cd2+濃度脅迫對水芹幼苗的毒害機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 水芹幼苗購自安慶山泉水生蔬菜研究所，采用浮床無基質栽培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)。

1.2 試驗設計 將水芹苗進行生根處理，數(shù)天后選擇長勢良好、株高和鮮重一致、多新鮮根的水芹苗留為試驗用。培養(yǎng)瓶采用500mL黑色聚乙烯瓶，在瓶蓋上鉆孔，苗采用海綿固定，每瓶培養(yǎng)5株幼苗，并通氣。將水芹苗移入含有400mL不同Cd2+濃度的Hoaglands營養(yǎng)液[3]中培養(yǎng)。采用5個鎘濃度梯度0.2、1、2、5、10mg·L-15個Cd2+水平和一個空白對照組，Cd2+由CdCl2提供，每個處理3個平行。每天10h的光照（15W日光燈），光照時培養(yǎng)溫度為25℃。10d后檢測Cd2+對水芹生長狀態(tài)和生理特征影響。

1.3 試驗方法

1.3.1 透射電鏡樣品的制備和電鏡觀察（1）取材固定：用手術刀片快速切取水芹葉片1mm2左右大小，用生理鹽水清洗組織，固定于4℃的2.5%戊二醛中6h，后取出后放到1.5mL離心管內(nèi)離心10min（2 000r/min）；（2）漂洗：用磷酸緩沖液（0.1mol·L-1，pH7.2）沖洗4次，每次間隔45min；（3）后固定：將組織后固定于1%鋨酸1h；（4）塊染：70%醋酸鈾乙醇飽和液中浸泡10h；（5）脫水：在30%、50%、80%、95%乙醇中依次脫水各15min，無水乙醇中脫水2次各40min；（6）滲透：環(huán)氧丙烷代換1次30min，環(huán)氧炳烷：環(huán)氧樹脂1∶1滲透2h，環(huán)氧炳烷∶環(huán)氧樹脂1∶2滲透1h，浸環(huán)氧樹脂（Epon812）2h；（7）包埋聚合：環(huán)氧樹脂包埋，后入45℃烤箱中12h，65℃烤箱中48h；（8）切片：取出包埋好的組織進行超薄切片，片厚70nm；（9）染色：將切好的片子水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中30min，雙蒸水洗×3次15min，入枸櫞酸鉛染液15min，雙蒸水洗×3次10min；（10）電鏡觀察和拍照：用日產(chǎn)JEM-1230型透射觀察并拍照[4]。

1.3.2 植物生化指標測定 鮮葉葉綠素含量的用二甲亞砜法[5]測定。MDA含量的測定：硫代巴比妥酸法（TBA）[6]；SOD、POD、CAT活性的測定：植物ELISA檢測試劑盒（北京天根生物有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有測定數(shù)據(jù)均為3次重復實驗的平均值±標準差（Mean±SD），并用SPSS 17.0進行方差分析，經(jīng)分析有效的數(shù)據(jù)（P<0.05）進行多重分析比較。

2 結果與分析

2.1 Cd2+對水芹幼苗葉片葉綠體超微結構的影響 研究結果表明，高濃度Cd2+對水芹幼苗葉片的葉綠體結構有明顯損傷，主要表現(xiàn)為葉綠體膨脹成圓球形，葉綠體空泡增多，基質片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少、排列不規(guī)則等現(xiàn)象。同時Cd2+的積累對細胞膜和細胞核有明顯的破壞，使細胞膜變薄，通透性增加，細胞核壓縮，密度增大。主要表現(xiàn)為：在低濃度下·Cd2+（0.2、1mg·L-1）與對照相比，水芹幼苗葉片的細胞超微結構沒有明顯變化，葉綠體外形呈長橢圓形，基質片層排列規(guī)則、清晰，基粒類囊體分布均勻；當Cd2+濃度達到2、5mg·L-1時，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積加大，基質片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；當Cd2+濃度達到10mg·L-1時，葉綠體膨大呈球形，基質片層排列不規(guī)則，類囊體逐漸消失，膜系統(tǒng)破壞明顯，細胞器損傷嚴重甚至解體（圖1）。

重金屬破壞葉綠體結構，使植物葉片葉綠素含量降低，降低光合強度，這是重金屬對植物毒害的普遍現(xiàn)象。有研究表明，葉綠體類囊體膜含不飽和的脂肪酸，因而對活性氧誘發(fā)的膜脂過氧化特別敏感，當體內(nèi)積累的Cd2+增多，使葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧過多而來不及清除，引發(fā)膜質過氧化，使葉綠體膜結構受到損傷，從而影響其功能[7]。宇克莉[8]等人研究認為，Cd2+脅迫下葉綠體膨脹成圓球形，可能是Cd2+導致滲透壓的變化引起的。可見對葉綠體超微結構的破壞作用是重金屬Cd對植物毒害的機制之一。

2.2 Cd2+對水芹幼苗葉綠素含量的影響 圖2表明，葉綠素a和總葉綠素含量在1mg·L-1時達到最大，說明低濃度鎘對葉綠素的產(chǎn)生有促進作用，葉綠素a/葉綠素b隨著Cd2+濃度的變化與葉綠素a變化一致。當Cd2+濃度升為2、5mg·L-1時，與最大含量相比，葉綠素總量和葉綠素a均顯著下降，同時與葉綠素a一致，葉綠素a/葉綠素b也顯著下降（P<0.05）。Somashekaraiah[9]等研究發(fā)現(xiàn)，導致葉綠素下降原因可能是重金屬影響葉綠素合成酶活性，也可能與葉綠素中Fe競爭作用[10]，還可能是促進葉綠素本身降解[11]，從而影響了葉綠素含量。其中葉綠素總量和葉綠素a下降速率大于葉綠素b，說明葉綠素a對Cd2+更敏感。葉綠素a/葉綠素b比值呈現(xiàn)上升趨勢，這是因為葉綠素a下降速率大于葉綠素b。

2.3 Cd2+對水芹幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響 由表1可知，與對照組比較，在Cd2+濃度逐漸增高條件下，水芹葉片中MDA、H2O2、O2·-含量均顯著上升（P<0.05），當Cd2+濃度達到10mg·L-1，增幅分別為166.67%、77.09%和85.90%。SOD與Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關系，而POD、CAT活性在整個濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。有研究表明，在低濃度Cd2+能夠促進植物代謝途徑，而高濃度則抑制酶活性[12]，導致代謝活性氧功能下降[13]。SOD、POD和CAT活性在0.2mg·L-1達到最大時，增幅分別為109.68%、和64.71%和40.29%，而在10mg·L-1時，CAT僅僅是對照組67%，這與周紅衛(wèi)[14]和馬劍敏[15]等人研究一致。研究顯示，低濃度Cd2+能使SOD、POD和CAT活性逐漸增加；高濃度Cd2+下，SOD起主要的保護作用，而POD和CAT的保護程度較低[16]。

3 結論

本試驗結果顯示，葉綠素含量的變化與葉綠體超微結構的變化之間有一定的關系。在低濃度Cd2+處理下，葉綠體結構沒有受到明顯損傷，此時的葉綠素含量與對照組相比也沒有明顯變化；隨著Cd2+濃度的升高，葉綠體超微結構逐漸受到破壞，主要表現(xiàn)為葉綠體膨脹成圓球形，葉綠體空泡增多，基質片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少、排列不規(guī)則等現(xiàn)象。在Cd2+濃度達到2、5mg·L-1時超微結構顯示，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積加大，基質片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；而當Cd2+濃度升為2、5mg·L-1時，與最大含量相比，葉綠素總量和葉綠素a均顯著下降。葉綠素a對Cd2+敏感性大于葉綠素b，在Cd2+濃度逐漸增高條件下，水芹葉片中MDA、H2O2、O2·-含量均顯著上升（P<0.05），SOD與Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關系，而POD、CAT活性在整個濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。

參考文獻

[1]申華，黃鶴忠，張皓.3種觀賞水草對水體鎘污染修復效果的比較研究[J].水生態(tài)學雜志，2008，9（1）：52-55.

[2]華大春，徐文娟，王昕.鎘在水芹不同器官中富集特性的研究[J].長江蔬菜，2013，18：74-76.

[3]余史丹，邱佳妹，王康才，等.銅、錳、鋅對麥冬光合特性和礦質元素的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2015（1）：7-10.

[4]王波，宋鳳斌，任長忠，等.鹽堿脅迫對燕麥葉綠體超微結構及一些生理指標的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2005，27（5）：473-477，485.

[5]劉柿良，楊容孑，馬明東，等.土壤鎘脅迫對龍葵幼苗生長及生理特性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2015（2）：240-247.

[6]李玲.植物生理學模塊實驗指導[M].北京：科學出版社，2009.

[7]Garnier L，Simon - plas F，Thuleau P.Cadmium affects tobacco cells by a series of three waves of reactive oxygen species that contribute to cytotoxicity[J].Plant Cell Environ，2006，29：1956-1969.

[8]宇克莉，孟慶敏，鄒金華.鎘對玉米幼苗生長、葉綠素含量及細胞超微結構的影響[J].華北農(nóng)學報，2010，25（3）：118-123.

[9]Somashekaraiah B V，Padmaja K，Prasad R K.Phytotoxicity of cadmiumions germination seedling of mung bean（Phaseolus vulgarize）involvement of lipid peroxides in chlorophyll degradation[J].Physiol Plant，1992，85（1）：85-89.

[10]Siefermann-Harms D.The yellowing of spruce in polluted atmospheres（Review）[J].Photosynthetica，1992（27）：323-341.

[11]嚴重玲，洪業(yè)湯，付舜珍，等.Cd、Pb 脅迫對煙草葉片中活性氧清除系統(tǒng)的影響[J].生態(tài)學報，1997，17（5）：488-492.

[12]田向榮 ，吳昊，李菁，等.Cd、Pb復合脅迫下濕地匍燈蘚（Plagiomnium acutum）重金屬累積效應及抗氧化系統(tǒng)響應[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2015，34（5）：844-851.

[13]何潔，高鈺婷，賀鑫，等.重金屬 Zn 和 Cd 對翅堿蓬生長及抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J].環(huán)境科學學報，2013，33（1）：312-320.

[14]周紅衛(wèi)，施國新，徐勤松.Cd2+污染水質對水花生根系抗氧化酶活性和超微結構的影響[J].植物生理學通訊，2003，39（3）：211-214.

[15]馬劍敏，靳同霞，李今，等.Hg2+、Cd2+及其聯(lián)合脅迫對伊樂藻的生長及POD和SOD活性的影響[J].河南師范大學學報（自然科學版），2006，34（4）：125-128.

[16]龍瑞，張明，張光生，等.Mn、Cd單一及其復合脅迫對伊樂藻生長及生理生化的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2014，33（6）：1112-1117.

（責編：張宏民）