基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在植物中的應(yīng)用

徐華山等

摘 要：基因組編輯技術(shù)是進(jìn)行農(nóng)作物基因功能研究和遺傳改良的重要輔助工具，目前已經(jīng)成熟應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)包括ZFNs、TALENs以及近幾年興起的CRISPR/Cas系統(tǒng)。該文介紹了ZFNs、TALENs及CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進(jìn)展、各自的優(yōu)缺點(diǎn)以及在植物中的應(yīng)用，并對基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：基因組編輯；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas；植物

中圖分類號 Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-15-05

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的物種基因組測序完成，研究基因功能成為了科學(xué)家下一步的工作重心。基因組編輯技術(shù)被《Science》評為2012年十大重要科學(xué)進(jìn)展之一，利用基因組編輯技術(shù)對植物基因進(jìn)行改造是進(jìn)行農(nóng)作物遺傳改良的重要輔助手段。目前應(yīng)用最多的基因組編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[1-2]，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like nucleases，TALENs）[3-4]以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)[5]。ZFNs是第一種由人工改造應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶，由含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子和非特異性的核酸內(nèi)切酶Fok I 的切割結(jié)構(gòu)域融合而成。盡管ZFNs成功應(yīng)用于多種生物的基因組編輯，但是設(shè)計(jì)困難、組裝昂貴、耗時(shí)長、失敗概率高等缺點(diǎn)限制了該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。TALENs是利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的核酸內(nèi)切酶Fok I 的切割結(jié)構(gòu)域融合而成的核酸內(nèi)切酶。TALENs實(shí)現(xiàn)了單個(gè)蛋白質(zhì)與單個(gè)核苷酸的對應(yīng)，與ZFNs相比更易組裝設(shè)計(jì)，打靶效率也更高[6-8]。2013年初，基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)改造的由RNA介導(dǎo)的全新人工核酸酶CRISPR/Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)了，與ZFNs和TALENs相比，該系統(tǒng)只需設(shè)計(jì)和目標(biāo)核苷酸對應(yīng)的RNA序列即可，操作手段更簡單，效率更高，成本更低，適合普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作，為基因組編輯提供了新的平臺(tái)。本文就3種基因組編輯技術(shù)的作用原理、結(jié)構(gòu)特征及使用特點(diǎn)等方面進(jìn)行介紹，并對基因組編輯技術(shù)在植物基因編輯中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)的原理及特點(diǎn)

1.1 ZFNs技術(shù) 鋅指核酸酶（ZFNs）是應(yīng)用較早的一類基因組編輯技術(shù)。該酶的N端是鋅指蛋白DNA結(jié)合域，可以識(shí)別并結(jié)合含特定堿基序列的DNA，C端是非特異性核酸酶Fok I的切割結(jié)構(gòu)域。鋅指蛋白根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的不同可以分為C2H2型、C4型和C6型，研究應(yīng)用比較多的是C2H2型。這種鋅指蛋白由30個(gè)氨基酸構(gòu)成并圍繞鋅離子折疊成ββα結(jié)構(gòu)，α螺旋插入DNA雙螺旋中可以特異識(shí)別DNA序列上的3個(gè)連續(xù)堿基并與之結(jié)合[9-10]。

人工合成的鋅指核酸酶由可以特異性識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白和非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI組成。鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域通常含有3～4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以特異性識(shí)別DNA上的3個(gè)連續(xù)堿基，因此每個(gè)鋅指核酸酶通?？梢蕴禺愋宰R(shí)別9～12bp的DNA序列。鋅指核酸酶與靶DNA結(jié)合后，F(xiàn)okI便在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行剪切造成DNA斷裂。如果切割時(shí)存在同源序列，則會(huì)發(fā)生DNA同源重組修復(fù)（HR），不存在同源序列時(shí)則以非同源末端連接（NHEJ）的方式進(jìn)行DNA修復(fù)，造成基因缺失、突變或堿基插入[11-12]。目前鋅指蛋白的設(shè)計(jì)和篩選方法主要有以下幾種：一是利用Sangamo Biosciences公司的專利設(shè)計(jì)鋅指核酸酶，該方法效率高，特異性強(qiáng)，可以商業(yè)化訂制，但是價(jià)格比較昂貴。二是利用開放平臺(tái)Oligomerized Pool Engineering（OPEN）設(shè)計(jì)鋅指核酸酶，該方法免費(fèi)向公眾開放，但是構(gòu)建過程需2～3個(gè)月，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。后來Joung等又開發(fā)了上下文依賴組裝（context-dependent assembly，CoDA）方法，可以在網(wǎng)站（http：//www.zincfingers.org/）上直接設(shè)計(jì)構(gòu)建，但是報(bào)道顯示該方法的成功率并不太高[13]。

1.2 TALENs技術(shù) 隨著重復(fù)可變雙殘基（repeat variable di-residues，RVDs）與核苷酸對應(yīng)關(guān)系的破解，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like nucleases，TALENs）的研究與應(yīng)用進(jìn)入快速發(fā)展階段，成為新的主流基因組編輯工具[6]。

與ZFNs類似，TALENs也由特異性蛋白與非特異性核酸酶FokI2個(gè)部分組成，特異性蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別目標(biāo)DNA序列并引導(dǎo)FokI對DNA進(jìn)行切割，造成DNA斷裂，斷裂的DNA通過HR或NHEJ機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。TALE蛋白來源于黃單胞桿菌Xanthomonas，這是一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有較大危害的植物病原菌。TALE蛋白的N端含有III型分泌信號肽，C端包含核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD），中間是決定特異性的DNA識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域[14]。DNA識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域由多個(gè)重復(fù)氨基酸單元串聯(lián)組成，每個(gè)單元含有34個(gè)氨基酸。每個(gè)重復(fù)單元的氨基酸序列幾乎一致，僅第12和13位可變，這2個(gè)可變氨基酸殘基稱為重復(fù)可變雙殘基（repeat variable di-residues，RVDs），每個(gè)重復(fù)單元可識(shí)別結(jié)合1個(gè)核苷酸，特異性就由RVDs決定。研究發(fā)現(xiàn)共有4種RVDs，每種RVDs特異識(shí)別結(jié)合1種核苷酸，其中NI（天冬酰胺和亮氨酸）識(shí)別堿基A，NN（2個(gè)天冬酰胺）識(shí)別堿基G或A，NG（天冬酰胺和甘氨酸）識(shí)別堿基T，HD（組氨酸和天冬氨酸）識(shí)別堿基C。因此RVDs的類型、數(shù)目及順序決定了TALENs識(shí)別DNA序列的特異性[15-16]。由于RVDs與核苷酸對應(yīng)關(guān)系比較簡單，每個(gè)RVDs特異識(shí)別結(jié)合1種核苷酸，因此與ZFNs相比，TALENs的可作用靶位點(diǎn)十分廣泛。每個(gè)TALENs大約包含20個(gè)左右的重復(fù)單元，組裝過程比較復(fù)雜，目前其組裝方法主要有以下3種：標(biāo)準(zhǔn)的限制性酶切和連接組裝法、Golden Gate組裝法及固相組裝法[17]。Golden Gate組裝法花費(fèi)少、構(gòu)建周期短、工作量小，是目前應(yīng)用最為廣泛的組裝方法，該方法利用IIS型核酸酶創(chuàng)造多粘性末端，一次反應(yīng)即可輕松連接多達(dá)10個(gè)重復(fù)單元。目前TALENs技術(shù)已經(jīng)在多種植物如煙草、水稻、短柄草及擬南芥中得到廣泛應(yīng)用。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng) 繼ZFNs和TALENs之后，針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究與應(yīng)用逐漸增多。與ZFNs和TALENs相比，作為后起之秀的CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方面載體構(gòu)建簡單，花費(fèi)更少，技術(shù)難度也更低。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）是指成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，Cas（CRISPR associated）是指與CRISPR 相關(guān)的蛋白。CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas蛋白組成，其中CRISPR序列由一些高度保守的重復(fù)序列和間隔序列相間排列組成，Cas蛋白是CRISPR序列附近相關(guān)基因編碼的蛋白酶，具有核酸酶活性，可對DNA序列進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂[18]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌自身的一套免疫系統(tǒng)。當(dāng)噬菌體或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系統(tǒng)識(shí)別外源DNA中特定的前間隔序列（protospacer）和前間隔序列鄰近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs）。宿主將這一新的間隔序列整合進(jìn)入CRISPR 系統(tǒng)，插入在前導(dǎo)序列和原先第一個(gè)重復(fù)序列之間。當(dāng)同一噬菌體或病毒再次侵染時(shí)，CRISPR 序列在前導(dǎo)序列引導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出前crRNA，前crRNA 接著被加工成小crRNA。這些crRNA 與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）形成一種復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)。復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)識(shí)別外源DNA中的spacer序列引導(dǎo)Cas蛋白復(fù)合體對外源DNA 序列進(jìn)行切割，從而保護(hù)宿主免受侵害。RISPR/Cas系統(tǒng)共分3個(gè)類型，I型和III型均需多個(gè)Cas蛋白參與形成復(fù)合體，II型僅需Cas9蛋白即可，使用更方便，因此目前研究應(yīng)用比較多的是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)[19-21]。

2012年，Jinek等[19]對II型CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA整合成一條單一引導(dǎo)RNA（single-guide RNA，sg RNA）仍能高效引導(dǎo)Cas9蛋白對DNA進(jìn)行切割。2013年，Cong等[20]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對人和小鼠細(xì)胞進(jìn)行了內(nèi)源基因的定點(diǎn)敲除。ZFNs和TALENs需構(gòu)建不同的融合蛋白來識(shí)別不同的DNA序列，操作過程比較繁瑣，花費(fèi)較大，CRISPR/Cas系統(tǒng)針對不同DNA序列只需設(shè)計(jì)不同的引導(dǎo)RNA即可，無需構(gòu)建蛋白。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)在煙草、擬南芥、高粱、水稻和小麥等多種植物基因編輯中得到廣泛應(yīng)用。

1.4 小結(jié) ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的基因組編輯工具，3種工具各具特點(diǎn)，研究者可根據(jù)具體情況選擇。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)作用原理見圖1，特點(diǎn)比較見表1。

2 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因編輯中的應(yīng)用

2.1 ZFNs在植物基因編輯中的應(yīng)用 ZFNs最初主要通過轉(zhuǎn)化或胚胎注射的方式導(dǎo)入到酵母或動(dòng)物胚胎細(xì)胞中，在細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行基因編輯。在植物方面，Wright等[22]在2005年構(gòu)建了融合GUS：NPT II基因（缺失600個(gè)堿基）的煙草原生質(zhì)體，然后利用電穿孔法將能識(shí)別GUS：NPT II基因序列的ZFNs及供體DNA（600個(gè)堿基）共同導(dǎo)入原生質(zhì)體中，結(jié)果10%以上的原生質(zhì)體發(fā)生了同源重組，其中20%的GUS：NPT II基因經(jīng)同源重組得到修復(fù)。該研究證明了ZFNs在植物基因編輯中應(yīng)用的可能性。ZFNs在植物應(yīng)用中的真正突破是2008年Maeder等[13]利用ZFNs技術(shù)將煙草中乙酰乳合酶基因SuRA敲除。2009年，Shukla等[23]利用ZFNs技術(shù)將抗除草劑基因插入到玉米內(nèi)源基因IPK中，在獲得的600個(gè)抗除草劑愈傷組織中檢測到了預(yù)期的變異。2013年，Curtin等[24]利用根毛轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究ZFNs技術(shù)對大豆基因組9個(gè)基因的誘變作用，發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因發(fā)生變異。作為多倍體物種，大豆的基因組高度重復(fù)，該研究表明ZFNs技術(shù)也可以用于高度重復(fù)基因組的基因編輯工作。

2.2 TALENs在植物基因編輯中的應(yīng)用 與ZFNs相比，TALENs在模塊構(gòu)建與成本花費(fèi)方面都有優(yōu)勢，在植物中的應(yīng)用也更廣泛。Cermak等[25]于2011年用Golden Gate組裝法構(gòu)建TALENs模塊，在擬南芥原生質(zhì)體中敲除ADH1基因，該研究表明TALENs在植物細(xì)胞內(nèi)具有定點(diǎn)突變的功能。Li等[26]于2012年利用TALENs技術(shù)破壞了水稻感病基因Os11N3的啟動(dòng)子序列，提高了水稻的抗病能力。2013年，Zhang等[27]利用TALENs技術(shù)編輯煙草SurA和SurB基因，他們將TALENs載體和供體DNA導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體，在4%的愈傷組織中檢測到了供體DNA 的標(biāo)記。Shan等[3]2013年利用TALENs技術(shù)對水稻和短柄草中的12個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變頻率為3.8%～100%。2015年，Shan等[28]利用TALENs技術(shù)編輯水稻OsBADH2、OsCKX2以及OsDEP1基因，突變率分別為9.7%、25.6%和9.2%，其中同時(shí)包含3個(gè)基因突變的植株為1.9%。以上研究表明TALENs技術(shù)在植物單基因突變和多基因突變方面都有較高的編輯效率。

2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因編輯中的應(yīng)用 與ZFNs和TALENs技術(shù)相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)載體構(gòu)建更為簡單，Cas9基因是相同的，針對不同的靶基因只需設(shè)計(jì)sgRNA而不需要設(shè)計(jì)組裝核酸酶，因此近幾年針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究與應(yīng)用迅速增多。2013年，Shan等[29]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)定點(diǎn)突變了小麥的1個(gè)基因和水稻的4個(gè)基因，并且在T0代獲得了水稻PDS基因功能缺失的純和突變體，該突變體呈現(xiàn)預(yù)期的白化和矮小。Li等[30]2013年利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在擬南芥和本生煙中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)突變并通過同源重組修復(fù)方式在煙草PDS基因的特定位點(diǎn)插入一個(gè)6bp的限制性酶切位點(diǎn)。Feng等[31]于2013年利用CRISPR/Cas系統(tǒng)分別對擬南芥和水稻進(jìn)行了基因組定點(diǎn)突變，利用不同啟動(dòng)子表達(dá)在擬南芥和水稻中表達(dá)Cas9基因和gRNA，結(jié)果表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以精確產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂及較高的突變效率（5%～84%），并且在T1代獲得了純和突變體。Miao等[32]于2013年采用玉米Ubi啟動(dòng)子在水稻中表達(dá)Cas9蛋白，成功地對水稻葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角控制基因LAZY進(jìn)行了靶向修飾，突變頻率分別為83.3%和91.6%。2014年，F(xiàn)eng等[33]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對擬南芥7個(gè)基因的12個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行修飾，T1代突變效率為30%～92%，T2代中單突變植株的后代有約22%為純合體，所有純合體均能穩(wěn)定遺傳至下一代。同年，Zhang等[34]對2個(gè)水稻亞種11個(gè)靶基因的研究顯示CRISPR/Cas系統(tǒng)在水稻中的編輯效率也是比較高的，約50%的基因編輯在胚性細(xì)胞第一次分裂前就已完成，后代檢測發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)可以穩(wěn)定遺傳且符合經(jīng)典孟德爾遺傳規(guī)律。2015年，Xu等[35]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)定點(diǎn)突變了水稻AOX1家族的3個(gè)基因（AOX1a，AOX1b，AOX1c），靶基因突變可在后代穩(wěn)定遺傳，而且通過精心選擇作用位點(diǎn)可顯著降低脫靶率。

3 展望

ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)，使基因組編輯工作取得了飛速進(jìn)展。ZFNs和TALENs出現(xiàn)早，使用時(shí)間長，但在具體的使用過程中技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時(shí)間較長，需要針對不同靶位點(diǎn)精心設(shè)計(jì)組裝蛋白分子，花費(fèi)昂貴，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以對任何NGG（PAM）前面的20bp序列進(jìn)行編輯，能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)，載體構(gòu)建比較簡單[19]。

所有基因組編輯工具都有一個(gè)無法避免的問題，即對基因組非特異性位點(diǎn)切割造成的脫靶效應(yīng)。理論上CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶率會(huì)高一些，而且CRISPR/Cas系統(tǒng)在不同物種中的脫靶率存在較大差異。目前利用各種方法降低CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶率，包括重新設(shè)計(jì)sgRNA以增強(qiáng)對靶DNA的親和力，根據(jù)不同的植物種類來優(yōu)化Cas蛋白的密碼子以增強(qiáng)其切割效率，尋找合適的靶位點(diǎn)增強(qiáng)CRISPR/Cas系統(tǒng)和靶DNA的轉(zhuǎn)一性?；蚪M編輯工具的脫靶效應(yīng)對人類基因組編輯來說是不能容忍的，但是對植物基因組編輯來說并不是太大的問題，只是脫靶率高會(huì)增加后代鑒定篩選的工作量。新型基因組編輯工具在植物中的廣泛應(yīng)用必將給植物育種帶來深遠(yuǎn)的影響，通過基因組編輯工具產(chǎn)生的植物是否和傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物同等對待，是對監(jiān)管部門的考驗(yàn)。新技術(shù)還帶來了一些專利、倫理及法律方面的問題，將引發(fā)人們持續(xù)的思考與討論。

致謝：本研究由“973”計(jì)劃項(xiàng)目（“水稻優(yōu)良品種的分子設(shè)計(jì)研究”分子設(shè)計(jì)和多基因組裝研究，2013CBA1405）、“863”計(jì)劃項(xiàng)目（“水稻抗褐飛虱分子設(shè)計(jì)與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)抗褐飛虱水稻新品種培育”子課題，2012AA101101）和農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“水稻分子與細(xì)胞工程育種”共同資助。

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