富含胸腺嘧啶DNA傳感探針對水體中Hg2+的檢測

肖 慧，楊 嬋，趙 珍，文家意，劉 鳳，周銀香徐思嘉，許庭琦，何婧琳，曹 忠

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點實驗室，微納生物傳感與食品安全檢測協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410004）

0 引言

近年來汞污染成為威脅動物及人類健康的一種重要方式，它來源于天然和人為活動，如火山爆發(fā)，采礦業(yè)，皮革鞣制和電鍍等[1]。因汞是一種毒性很強(qiáng)的元素，人體吸收環(huán)境中的汞之后，通過生物富集作用和食物鏈傳遞，進(jìn)入人體內(nèi)部,特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng),導(dǎo)致各種疾病[2]。當(dāng)進(jìn)入血液后，首先會同血液中的血漿蛋白或血紅細(xì)胞結(jié)合，然后分布到腎臟與腦部，最后再分布到心、肺、肝、腸壁等處，而且對呼吸道、消化道也會有一定影響。由于汞元素對身體存在著極大的危害性，世界衛(wèi)生組織把汞列為首要考慮的對環(huán)境有危害的污染物[3]。汞中毒一般是由汞離子引起的，由于它參與一些重要的生物反應(yīng)，如和人體蛋白的巰基絡(luò)合形成金屬蛋白，從而抑制了酶活性，使人體的肝臟和腎臟等受到損害，引起尿毒白、血尿等病變，因此汞已被廣泛認(rèn)為可危害動物物種包括人類健康的重要來源[4]。

Thymine-Hg2+-Thymine(T-Hg2+-T)這種結(jié)構(gòu)在近幾年引起研究者們的廣泛關(guān)注，T-T能與Hg2+特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，將T作為識別基團(tuán)通過一定的連接體將其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因連接起來就可以構(gòu)建有機(jī)小分子Hg2+傳感器[5]。T-T錯配對汞離子有很高的選擇性，而且T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比匹配的A-T結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高[6-8]。 例如：Bin Liu等[9]利用Hg2+不存在時，5'-18T-3'與5'-18A-3'由于堿基互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，加入熒光基團(tuán)SYBR Green I，熒光信號減弱。標(biāo)記核酸適體被廣泛運(yùn)用到基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的 Hg2+檢測中[10-11]，例如：Ono 等[10]利用一條兩端分別修飾了熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的DNA探針，在Hg2+存在時，形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互靠近并發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)換，使得熒光被猝滅。 還有很多傳感平臺被用來檢測Hg2+，如基于聚合物[12]、小分子作為熒光基團(tuán)[13]、DNA-zymes[14]、抗體[15]、脂質(zhì)體[16]等化學(xué)生物傳感器。由于基于核酶的熒光傳感器快捷方便、分子結(jié)構(gòu)易于修飾、重金屬離子效應(yīng)和靈敏度高等優(yōu)點，引起研究者們的興趣，但基于核酶熒光傳感器大多數(shù)需要對核酸進(jìn)行熒光標(biāo)記，使得實驗樣品處理繁雜且花費(fèi)較高[17-18]，而且對核酸的標(biāo)記可能導(dǎo)致合成過程中DNA損傷，使其對Hg2+的結(jié)合能力減弱，因此開發(fā)免標(biāo)記熒光方法檢測Hg2+顯得較為必要。

實驗設(shè)計了一種基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)和熒光增強(qiáng)的Hg2+傳感器，利用Hg2+存在時，43mer-T18stem與Hg2+形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，加入可嵌入DNA雙鏈的SYBR Green I時，得到較強(qiáng)的熒光信號。Hg2+不存在時SYBR Green I與單鏈43mer-T18stem結(jié)合較弱，熒光信號較弱。該方法操作簡單、價格低廉、選擇性高，為快速檢測Hg2+提供了一種新途徑。這個新策略還可提供多通道檢測、分子組裝、分子邏輯門的研究方法[19-22]。

1 實驗部分

1.1 試劑

核酸適體探針序列見表1，購買于生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green I(SG，20×)購于上海捷瑞生物工程有限公司；氯化鈉、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸、三羥甲基氨基甲烷購自于湖南化學(xué)試劑廠，均為分析純級別。

表1 核酸適體探針序列Tab.1 The sequence of the DNA probes

1.2 實驗方法

1.2.1 核酸適體探針溶液的配制

配制含有 1.000×10-1mol/L NaNO3、5.000×10-3mol/L KNO3的 2.000×10-2mol/L Tris-HNO3溶液，用PHSJ-3F型實驗室pH計 (上海雷磁儀器廠)將pH調(diào)至7.4。將此溶液作為43mer-T18stem的緩沖液。用相同的方法配置55mer-stem溶液。實驗配備非生物試劑所用水均為超純水，配備生物試劑所用水及實驗器皿均用手提式壓力蒸汽滅菌器（新豐醫(yī)療器械有限公司，浙江）進(jìn)行高溫高壓滅菌，沖洗所用水均為蒸餾水。

1.2.2 Hg2+溶液的配制

配制1.000×10-1mol/L Hg(NO3)2溶液，用 pH=7.4的Tris-HNO3溶液稀釋至所需濃度。同樣方法分別配制 pH=5、pH=6、pH=8、pH=9 的 Tris-HNO3溶液稀釋至所需濃度。

1.2.3 Hg2+的檢測

43mer-T18stem（15 μL，5.000×10-4mol/L）和特定濃度的Hg2+在1 mL離心管中混合，將混合液置于室溫下反應(yīng)30 min后，加入1 μL 20×SG混合均勻，最后在激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度分別為 5.0 nm 和 10.0 nm，激發(fā)波長為 495 nm,發(fā)射光強(qiáng)度在494～620 nm范圍的LS-45(美國Perkin Elmer公司)熒光分光光度計對混合液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描?？瞻讟悠?3mer-T18stem （15 μL，0.500 mmol/L）和 84 μL pH 為 7.4 的 2.000×10-2mol/L Tris-HNO3緩沖溶液在1 mL離心管中混合。所有檢測均在室溫下完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本原理

圖1 發(fā)夾探針傳感方法熒光檢測Hg2+的原理圖Fig.1 Schematic illustration of the 43mer-T18stem probe sensing method for the detection of Hg2+

實驗原理如圖1所示，富含18個胸腺嘧啶（T）的單鏈DNA在Hg2+存在的條件下由于二者的特異性識別作用可形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入SYBR Green I（SG）后，可以觀察到明顯的熒光信號。這是因為當(dāng)Hg2+存在時，該單鏈寡聚核苷酸與Hg2+特異性結(jié)合形成類似雜交雙鏈DNA的復(fù)合體，當(dāng)雙鏈嵌入劑SG嵌入該復(fù)合體內(nèi)，熒光增強(qiáng)。而Hg2+不存在時，SG與單鏈寡聚核苷酸43mer-T18stem結(jié)合熒光較弱，甚至沒有，故熒光信號較弱。

2.2 55mer-stem和43mer-T18stem核酸探針的選擇

不同單鏈DNA探針與Hg2+結(jié)合能力不一樣，為了得到最佳的信背比，選擇能夠形成最佳T-T錯配雙鏈DNA的探針序列，實驗考察了兩種不同的核酸DNA鏈55mer-Stem和43mer-T18Stem 對 Hg2+的響應(yīng)。 在 55μL 1.000×10-6mol/L Hg2+15 μL 5.000×10-4mol/L 的 DNA 鏈探針及 1 μL 0.2×conc.SG 條件下， 按照 Hg2+的檢測方法，探索表1中不同DNA鏈探針的熒光強(qiáng)度變化，空白樣用Tris-HNO3代替。結(jié)果如圖2所示，從結(jié)構(gòu)上分析，55mer-Stem是一條含55個堿基的核酸鏈，其中T-T結(jié)合的序列為26個，加入Hg2+后形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，信背比為0.3839。43mer-T18Stem中T-T結(jié)合的序列增多，加入Hg2+后形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)更多，SG更易于嵌入雙鏈中，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，信背比為0.9911。因此，實驗選43mer-T18Stem探針來完成接下來的實驗。

2.3 傳感體系制作過程熒光光譜考察

圖2 核酸鏈1和核酸鏈2兩種探針在空白和1.000×10-6mol/L Hg2+溶液中的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of 55mer-Stem and 43mer-T18Stem probes in the absence or presence of Hg2+.The concentration of Hg2+was 1.000 × 10-6mol/L

圖3 熒光染料(a)、熒光染料+汞離子(b)、核酸鏈1(c)、核酸鏈1+熒光染料(d)、核酸鏈1+熒光染料+汞離子(e)的熒光光譜圖。其中熒光染料的濃度是0.2×concFig.3 Fluorescence spectra of the following solutions.SG(a);the mixture of Hg2+and SG(b);43mer-T18Stem(c);the mixture of 43mer-T18Stem and SG in the absence(d)or presence(e)of Hg2+.The concentration of SG was 0.2×conc

為了考察傳感體系中各組分的熒光性質(zhì)，實驗對各組分的溶液進(jìn)行了熒光檢測。實驗結(jié)果如圖3，當(dāng)溶液中只加入SG（曲線a）時的熒光強(qiáng)度為55.70，表明SG本身具有微弱的熒光特性。當(dāng)1.000×10-6mol/L Hg2+存在時（曲線 b）的熒光強(qiáng)度為42.97，曲線b的熒光強(qiáng)度比曲線a的熒光強(qiáng)度略低，表明Hg2+對SG本身具有微弱的熒光淬滅作用。當(dāng)溶液中只有43mer-T18Stem時，熒光強(qiáng)度很微弱（曲線 c），即 60.05；這是因為 43mer-T18Stem鏈本身也有微弱熒光。而在43mer-T18Stem溶液中加入SG時，熒光強(qiáng)度增大到309.3（曲線d），該文課題組推測，這是因為43mer-T18Stem會發(fā)生自身的部分折疊而導(dǎo)致的。 當(dāng) 1.000×10-6mol/L Hg2+存在時，43mer-T18Stem/SG傳感體系的熒光強(qiáng)度為563.9（曲線e)，這表明富含T堿基的43mer-T18Stem鏈與Hg2+能特異性的結(jié)合形成T-Hg2+T穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使SG更容易嵌入到T-Hg2+T結(jié)構(gòu)中，發(fā)出強(qiáng)的熒光信號。因此，該傳感體系可以用于Hg2+的檢測。

2.4 pH值的優(yōu)化

為了考察pH值對檢測體系的影響，在傳感器分別對 Tris-HNO3的 pH 為 5.0、6.0、7.4、8.0、9.0時的熒光進(jìn)行比較。由圖4可知，空白樣的熒光強(qiáng)度隨著pH值變化很小，而目標(biāo)Tris-HNO3的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)Tris-HNO3的pH為7.4時，信背比最大，因此，pH=7.4是最佳的反應(yīng)條件，在此條件下Hg2+能更好的形成T-Hg2+-T，從而達(dá)到最佳的熒光增強(qiáng)效果。

圖4 核酸鏈1/熒光染料體系在空白和1.000×10-6 mol/L Hg2+溶液中隨pH變化的熒光響應(yīng)圖Fig.4 Fluorescence responses of 43mer-T18Stem/SG system in the absence or presence of Hg2+at different pH of Tris-HNO3buffer solution.The pH was 5.0,6.0,7.4,8.0,9.0 and the concentration of Hg2+was 1.000×10-6mol/L

2.5 培育時間的優(yōu)化

為了考察培育時間對檢測體系的影響，在1.000×10-6mol/L Hg2+、43mer-T18Stem 及 0.2×conc.SG、Tris-HNO3pH為7.4的條件下，分別調(diào)整培育時間為 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。如圖5所示，在空白實驗中，培育時間對于熒光響應(yīng)的影響不大。在檢測1.000×10-6mol/L Hg2+時，當(dāng)培育時間從10 min到30 min時，目標(biāo)樣品的熒光強(qiáng)度隨著培育時間的增大而增大，30 min之后則隨著培育時間的增大而熒光響應(yīng)減小。因此，實驗的最優(yōu)培育時間為30 min。

圖5 核酸鏈1與Hg2+及Tris-HNO3在不同反應(yīng)時間(10、20、30、40、50 min)下與熒光強(qiáng)度響應(yīng)圖Fig.5 Time course of incubating proposed sensor(10 min,20 min,30 min,40 min and 50 min)in the absence or presence of 1.000×10-6mol/L Hg2+

2.6 分析性能

實驗在最佳的條件下，對不同濃度的Hg2+進(jìn)行了定量檢測。如圖6(A)所示，能觀察到熒光強(qiáng)度隨著 Hg2+濃度在 4.000×10-7～2.000×10-6mol/L的范圍內(nèi)增加而增加，這是因為隨著Hg2+濃度的增加，T-Hg2+-T穩(wěn)定結(jié)構(gòu)越來越多，嵌入的SG也增多，所以熒光強(qiáng)度增大。圖6(B)為Hg2+濃度與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖，選擇SG的最大發(fā)射波長525 nm處的熒光強(qiáng)度為定量依據(jù)并有良好的響應(yīng)，且熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度之間的線性關(guān)系為ΔF=0.4744c[Hg2+]+72.50，其中 r2=0.9874，線性范圍是 4.000×10-7～2.000×10-6mol/L， 檢 出限為3.900×10-7mol/L。

圖6 (A)核酸鏈 1 探針傳感體系對一系列濃度 Hg2+（從下至上：4.000×10-7、6.000×10-7、7.500×10-7、1.000×10-6,1.500×10-6和 2.000×10-6mol/L）的熒光光譜圖；(B)熒光強(qiáng)度與 Hg2+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 (A)Fluorescence spectra of 43mer-T18Stem with various concentrations of Hg2+（from bottom to top:4.000×10-7,6.000×10-7,7.500×10-7,1.000×10-6,1.500×10-6,2.000×10-6mol/L);(B)Linear fluorescence response to the Hg2+concentrations

2.7 干擾離子的影響

在最優(yōu)實驗條件下，考察常見的金屬離子K+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+對 Hg2+檢測的干擾程度，在沒有 Hg2+存在的條件下，檢測 K+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+的熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖7所示：各金屬離子對傳感體系的熒光強(qiáng)度影響非常小，而目標(biāo)物Hg2+存在時的熒光響應(yīng)值最高，也就是說SG對Hg2+有特異的選擇性。 說明該方法對Hg2+有良好的選擇性。

2.8 回收率的測定

在最優(yōu)實驗條件下，將湘江水用緩沖溶液稀釋20倍，制成含有5%湘江水的實際水樣。滴加Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 4.000×10-7、6.000×10-7、7.500×10-7、1.000×10-6、1.500×10-6和 2.000×10-6mol/L，測定各溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)線性方程算出Hg2+含量，計算回收率（如表2所示），測得的回收率為 98.72%～104.5%，因此該傳感器可用于實際水樣中Hg2+的測量。

圖7 傳感探針檢測干擾離子和Hg2+的熒光光譜圖（從上至下：Hg2+,blank,Cu2+,Zn2+,Fe3+,Pb2+,K+）Fig.7 The fluorescence spectra of the proposed sensor in different metal ion solutions(from top to bottom:Hg2+,blank,Cu2+,Zn2+,Fe3+,Pb2+and K+)

3 結(jié)論

該文利用T-T與Hg2+特異性作用形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)與DNA嵌入劑（SG）設(shè)計了一種新型的汞離子熒光傳感器。利用熒光染料SG嵌入雙鏈DNA能產(chǎn)生較高熒光的作用，在不同濃度下Hg2+對傳感體系的響應(yīng)做了熒光定量分析。在最優(yōu)實驗條件下，汞（Ⅱ）離子濃度與熒光信號值在 4.000×10-7mol/L～2.000 ×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，最低檢測濃度為 3.900×10-8mol/L。該方法對汞（Ⅱ）表現(xiàn)出較好的選擇性，可用于實際環(huán)境水樣中汞（Ⅱ）的靈敏檢測，在設(shè)計上具有普遍應(yīng)用性且不需要預(yù)處理，可直接進(jìn)行測定，操作簡單、價格低廉，整個操作過程綠色、環(huán)保，且檢測響應(yīng)快速，選擇性良好，具有良好的應(yīng)用前景。

表2 回收率的測定Tab.2 Recovery of Hg2+in Real Samples

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