共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用研究新進(jìn)展

張順超， 沈國(guó)勵(lì)， 李合松*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410082)

1 引言

共振能量轉(zhuǎn)移(Resonance Energy Transfer，RET)是指發(fā)生在距離足夠近(一般小于10 nm)的供體與受體之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移。其中，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)作為一種應(yīng)用較廣泛的分析技術(shù)，已經(jīng)成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[1]，核酸、免疫分析[2]等領(lǐng)域。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET)作為一種天然的生物物理學(xué)過程，也成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子相互作用的研究[3 - 4]。然而FRET存在光漂白、需要激發(fā)光源等缺點(diǎn)，BRET在供受體對(duì)的選擇上受到極大的限制。近年來，人們發(fā)展了一種新的能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，即化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Chemiluminescence Resonance Energy Transfer，CRET)。由于CRET不需要激發(fā)光源、不存在光漂白現(xiàn)象，有望進(jìn)一步拓寬能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，CRET在蛋白質(zhì)分析[5]、核酸分析[6]等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們的廣泛關(guān)注。本文依據(jù)供受體對(duì)的不同，對(duì)RET技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，展望了其應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)。

2 共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的原理

RET的產(chǎn)生必須具備兩個(gè)條件，一是供體的發(fā)射光譜和受體的激發(fā)(或吸收)光譜必須有部分重疊；另外供體和受體之間的距離必須足夠小(一般小于10 nm)。FRET是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)(供體)的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)(受體)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離足夠近時(shí)(一般小于10 nm)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即熒光供體受激發(fā)時(shí)，可觀察到熒光受體發(fā)射的熒光。

3 共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用

3.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用

FRET具有分析速度快、方法靈敏度高、選擇性好、無污染或污染小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)中生物分子的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究，如核酸分析[8，9]、免疫分析[10，11]、蛋白質(zhì)分析[12 - 15]、糖類分析[16]等。因其具有高選擇性，近年來也逐漸應(yīng)用于與臨床相關(guān)的藥物分析[17 - 20]。

3.1.1核酸分析核酸的研究備受廣大科研工作者的關(guān)注。如使用傳統(tǒng)的有機(jī)染料作為能量供受體對(duì)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的DNA探針，可以使用FRET技術(shù)在分子水平上研究DNA的結(jié)構(gòu)[21]。Zhang等[22]合成了熒光陽(yáng)離子水溶性共軛聚合物(CCP)，對(duì)35種卵巢癌癥樣本RASSF1A、OPCML和HOXA9啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了DNA甲基化水平分析，結(jié)果表明該方法診斷和篩查癌癥具有巨大的應(yīng)用潛力。Yang等[23]同樣通過陽(yáng)離子共軛聚合物熒光探針，分析了結(jié)腸癌啟動(dòng)子甲基化水平，為FRET技術(shù)應(yīng)用于癌癥的診斷治療提出了新的思路。Martí等[24]建立了一種新型的自旋禁止FRET技術(shù)，用釕吡啶復(fù)合物標(biāo)記的DNA作為供體，Cy5標(biāo)記的DNA作為受體，當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，發(fā)生FRET，據(jù)此高靈敏檢測(cè)了目標(biāo)DNA。

使用傳統(tǒng)的分子信標(biāo)技術(shù)，通過FRET分析可在細(xì)胞水平上精確地觀察活體細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，但早期的FRET主要使用傳統(tǒng)的有機(jī)染料作為能量供受體對(duì)，存在熒光壽命短，斯托克斯位移小(易發(fā)生發(fā)光光譜重疊)，能量轉(zhuǎn)移效率低等缺陷，在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。因此，尋找新的能量供受體對(duì)為研究FRET的關(guān)鍵。納米材料，特別是量子點(diǎn)(Quantum Dot，QDs)的出現(xiàn)，解決了熒光壽命短的缺陷，使FRET得到不斷的發(fā)展，極大的擴(kuò)大了其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[25]。另外，一些新型納米材料的出現(xiàn)并作為能量受體和反應(yīng)載體，如金納米(AuNPs)、碳納米管、石墨烯、氧化石墨烯(GO)等，使得供受體對(duì)之間的轉(zhuǎn)移距離增大[26]，使FRET的應(yīng)用范圍更為廣泛。Jin等[27]建立了一種簡(jiǎn)單有效地在均相水平上篩選G-四鏈體配體的新方法，該法將熒光素標(biāo)記的G-四鏈體DNA(FAM-DNA)通過靜電吸附在AuNPs上，發(fā)生FRET，結(jié)果表明用FRET方法篩選G-四鏈體配體簡(jiǎn)單、靈敏、有效，并有望在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出鑒別具有抗癌活性配體的方法。Lu等[28]合成帶正電的十六烷基三甲基溴化銨修飾的金納米棒(CTAB-AuNRs)，熒光素標(biāo)記的單鏈DNA(FAM-ssDNA)可通過靜電吸附在CTAB-AuNRs上，發(fā)生FRET。Zhang[29]等使用納米銀結(jié)合低聚核苷酸DNA，研究了發(fā)生FRET的距離，結(jié)果表明引入AgNPs后發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的距離增加至13 nm，從而有望將其用于比標(biāo)準(zhǔn)福斯能量轉(zhuǎn)移距離大的供受體的研究。Dong等[30]研究了QDs和GO作為供受體對(duì)，QDs標(biāo)記的分子信標(biāo)(QDs-MB)可通過π-π共軛連接到GO上，基于此建立了GO-FRET技術(shù)檢測(cè)DNA的方法。這類基于FRET檢測(cè)DNA的方法都具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已用于活體細(xì)胞的DNA檢測(cè)?；贔RET的核酸分析日趨成熟，已發(fā)展由液相分析到固相分析的轉(zhuǎn)變[31]。Krull等[32]在紙上固定多色QDs，結(jié)合相應(yīng)的熒光染料能量受體標(biāo)記的DNA，構(gòu)建了一個(gè)在非均相水平上多元檢測(cè)DNA的新技術(shù)。FRET技術(shù)在核酸分析上的應(yīng)用，使人們對(duì)核酸的研究更加深入，同時(shí)，分析方法的多樣化，有利于推動(dòng)核酸研究的快速發(fā)展。

3.1.2蛋白質(zhì)分析FRET可作為精確的“光學(xué)分子尺”，已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子內(nèi)部特定位點(diǎn)之間距離的測(cè)量等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用[33]。Wruss等[34]基于FRET，在極低密度脂蛋白受體衍生物V33333-His6的N端修飾上熒光素作為能量供體，在其C段鍵合上猝滅劑QSY7-S-Tris-NTA作為能量受體，實(shí)驗(yàn)表明在2 μmol/L的Ni2+存在下，tris-NTA對(duì)His6具有很強(qiáng)的親合性，從而找到了對(duì)His6更優(yōu)越的熒光標(biāo)記試劑QSY7-S-tris-NTA。Pihlasalo等[35]基于時(shí)間分辨FRET，設(shè)計(jì)了檢測(cè)低濃度蛋白的分析方法，結(jié)果表明該方法具有簡(jiǎn)便快速、樣品消耗量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，而且檢測(cè)過程不需要引入有毒的底物，也不需要嚴(yán)格的控制溫度。Goswami等[36]采用kynurenine氨基酸和結(jié)晶紫作為能量供受體,基于FRET原理研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，拓寬了FRET在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用。

基于納米材料的FRET用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)同樣發(fā)展迅速。Wang等[37]在微流/納流芯片中構(gòu)建了一個(gè)V形預(yù)反應(yīng)器，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的狗血清白蛋白(FITC-DSA)共軛連接到AuNPs上形成AuNPs納米探針(FITC-DSA-AuNPs)，由于AuNPs與FITC-DSA之間發(fā)生FRET，從而定量分析了胰蛋白酶的活性。Li等[38]設(shè)計(jì)了一個(gè)AgNPs增強(qiáng)FRET傳感器用于測(cè)量人類血小板源生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)，熒光團(tuán)TAMRA功能化的生物素化PDGF-BB適配體(Biotin-PDGF-BB-TAMRA)和猝滅劑BHQ-2標(biāo)記的互補(bǔ)DNA通過親和反應(yīng)結(jié)合到功能化的AgNPs上，由于適配體鏈與其互補(bǔ)鏈相互雜交發(fā)生FRET，結(jié)果表明使用AgNPs增強(qiáng)FRET傳感器具有更高的靈敏度，對(duì)PDGF-BB的檢測(cè)限達(dá)到0.8 ng/mL。Hong等[39]基于FRET，鏈霉親和素(SA)功能化的QDs作為能量供體，生物素化的AuNPs作為能量受體(作為猝滅劑)，設(shè)計(jì)了檢測(cè)抗生物素蛋白的分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、檢出限達(dá)到10 nmol/L。Chang等[40]利用FAM標(biāo)記的DNA適配體(FAM-Aptamer)可π-π共軛連接到GO上，發(fā)生FRET，基于這種新納米材料作為熒光受體，靈敏地檢測(cè)了凝血酶，檢測(cè)限達(dá)到了31.3 pmol/L。

3.1.3免疫分析免疫分析技術(shù)主要包含均相法和非均相法。均相法操作較簡(jiǎn)單、誤差小、靈敏度高且應(yīng)用較廣。其中，均相FRET免疫分析方法，選擇合適的能量供受體對(duì)，已廣泛應(yīng)用于小分子半抗原和大分子抗體的檢測(cè)[41，42]。隨著納米科學(xué)的飛速發(fā)展，特別是一些新型納米材料，如QDs、碳納米管、石墨烯、上轉(zhuǎn)換納米材料等的出現(xiàn)極大地豐富了FRET供受體對(duì)的選擇，擴(kuò)大了FRET技術(shù)在免疫分析上的應(yīng)用[43 - 47]。Liu等[48]采用雙光子熒光染料TP-NH2作為能量供體，DABS作為能量受體，使用免疫夾心法，建立了基于免疫分析的TPE-FRET檢測(cè)抗體牛血清蛋白，該方法背景信號(hào)低，且具有靈敏度高，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。Kokko等[10]基于FRET，一個(gè)抗體使用過渡金屬離子鋱標(biāo)記作為FRET供體，另外兩個(gè)抗體分別標(biāo)記的熒光素Alexa Fluor(AF)488和Alexa Fluor 680作為受體，建立了均相雙參數(shù)免疫分析法。該方法簡(jiǎn)單、快速、背景干擾少且檢測(cè)限低。目前，基于FRET免疫分析已成功應(yīng)用于臨床診斷分析。Long等[49]利用小分子BPA功能化石墨烯作為能量受體，熒光標(biāo)記的BPA抗體作為能量供體，開發(fā)了一種均相免疫競(jìng)爭(zhēng)方法用來檢測(cè)小分子BPA，檢測(cè)限達(dá)到0.1 nmol/L，可以作為新的小分子快速檢測(cè)手段。Kuningas課題組[50]基于上轉(zhuǎn)換FRET，利用上轉(zhuǎn)換熒光納米作為FRET供體，雌二醇偶聯(lián)的小分子染料作為FRET受體，建立了均相免疫測(cè)定雌二醇的方法。開發(fā)新的熒光供受體對(duì)，結(jié)合免疫分析，可以擴(kuò)大FRET在生命分析中的應(yīng)用。

3.1.4糖類分析應(yīng)用FRET于糖類的分析相對(duì)較少，這主要可能與在糖的結(jié)構(gòu)中同時(shí)修飾上兩個(gè)熒光團(tuán)構(gòu)建FRET相對(duì)困難有關(guān)。但近些年來，F(xiàn)RET技術(shù)應(yīng)用于糖類分析開始受到科研工作者的關(guān)注。Blagoi等[51]基于FRET，用血凝素標(biāo)記的熒光素作能量供體，右旋糖苷標(biāo)記的紅色染料Texas作能量受體，研究了碳水化合物和糖蛋白類與右旋糖苷對(duì)血凝素的的競(jìng)爭(zhēng)親合性，同時(shí)用該方法檢測(cè)了水溶液樣品中碳水化合物和糖蛋白類的含量。Furchak等[52]基于FRET，在適體酶的催化下，檢測(cè)6-磷酸鹽葡萄糖胺，檢測(cè)限為500 μmol/L。Chang等[53]基于QDs的FRET，結(jié)合毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)超靈敏快速地檢測(cè)了酸性二糖。使用鏈霉親和素(SA)化的CdSe -ZnS QDs作為能量供體，親和素(biotin)和Cy5雙重標(biāo)記的二糖作為受體，構(gòu)建二糖的FRET體系，結(jié)合CE-LIF定量分析了硫酸軟骨素二糖。

3.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用

BRET與FRET相比，具有更多的優(yōu)勢(shì)，例如：它不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞光敏、沒有熒光團(tuán)的光漂白和自身熒光背景的影響等。目前，它已經(jīng)普遍用于蛋白質(zhì)之間的相互作用機(jī)制，非侵入性活細(xì)胞及活體成像等研究中。隨著新的熒光蛋白受體(如海腎熒光素，腔腸熒光素，二脫氫腔腸熒光素)的發(fā)現(xiàn)，BRET技術(shù)有了新的發(fā)展，其主要表現(xiàn)在G蛋白受體的偶聯(lián)的監(jiān)測(cè)[54，55]、G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的功能與運(yùn)行規(guī)律的研究[56]方面的應(yīng)用。BRET供受體間的距離一般限制在10 nm以內(nèi)，超過此距離時(shí)能檢測(cè)的信號(hào)非常的小。這也與G蛋白偶聯(lián)受體的研究相關(guān)，因?yàn)镚蛋白偶聯(lián)受體7個(gè)跨膜螺旋核的直徑大概是5 nm。這表明，BRET能夠應(yīng)用于研究G蛋白偶聯(lián)受體的低聚反應(yīng)[57]和受體G蛋白的偶聯(lián)或抑制蛋白的監(jiān)測(cè)，從而研究與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的功能與規(guī)律。Yoshida等[58]通過染色體免疫沉淀法結(jié)合鋅指熒光素酶構(gòu)建BRET體系用于檢測(cè)表觀遺傳修飾-組蛋白的修飾，使用該方法，準(zhǔn)確地檢測(cè)了LNCaP和Du145細(xì)胞上雄激素受體基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白的修飾。同樣，結(jié)合甲基-CpG-鍵合域蛋白質(zhì)或甲基胞苷抗體，成功檢測(cè)了DNA甲基化。該方法能成功地應(yīng)用于臨床診斷分析。Michelini等[59]基于BRET，建立了檢測(cè)體內(nèi)植物雌激素復(fù)合物的分析方法，該方法可用于評(píng)測(cè)植物雌激素的活性以及評(píng)估從生物相關(guān)樣品中合成外源性雌激素。

目前，BRET體系主要是使用熒光蛋白作為受體，新的BRET受體需要改善一些特證，如Stokes位移能在大于600 nm的長(zhǎng)波上發(fā)射熒光，以便獲得多功能的BRET體系進(jìn)而提高它在細(xì)胞內(nèi)成像的實(shí)用性和靈敏度。QDs可以在大于600 nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)處發(fā)光，且具有較好的生物相容性，容易利用生化方法將它們鍵合到表達(dá)蛋白上，且更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。Rao課題組發(fā)展的QDs-BRET體系，使用內(nèi)含子中間調(diào)節(jié)的化學(xué)方法偶聯(lián)納米粒子，將生物發(fā)光蛋白Luc8的C端通過底物肽蛋白連結(jié)到QD表面，用于檢測(cè)蛋白酶的活性[60]。Hasegawa等[61]通過重組蛋白技術(shù)合成谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記的海腎螢光素酶(GST-RLuc)-腔腸素作為能量供體，谷胱甘肽(GSH)包裹的近紅外(NIR)CdSeTe/CdS QDs(GSH-QDs)作為能量受體，發(fā)生CRET，已成功應(yīng)用于動(dòng)物內(nèi)的淋巴結(jié)和血管成像。Hsu等[62]建立了一種活體內(nèi)光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)的BRET新方法。當(dāng)加入底物腔腸素時(shí)，海腎熒光素酶固定的QDs-655(QDs-RLuc8)產(chǎn)生BRET，QDs發(fā)出的光進(jìn)一步活化膠束中包裹的光敏劑Foscan，使產(chǎn)生活性氧(ROS)從而殺死癌細(xì)胞，有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展，可以用BRET技術(shù)研究大量的存在潛在相互作用的蛋白質(zhì)，從而有助于揭示疾病發(fā)生的病理生理過程。在此基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步識(shí)別新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)方面具有很大的潛力。同時(shí)，開發(fā)新的生物能量供受體，仍然是BRET技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

3.3 化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用

與FRET不同，CRET不需要外部激發(fā)光源，它是由化學(xué)發(fā)光(CL)底物作為能量供體，隨后將氧化反應(yīng)產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給合適的受體分子，是一個(gè)非輻射能量轉(zhuǎn)移過程。主要的CL體系有魯米諾(Luminol)、吖啶酯化合物、過氧化草酸酯等。其中，Luminol是CL體系中最為廣泛研究與應(yīng)用的試劑。一般情況下，在堿性水溶液中，適當(dāng)?shù)难趸瘎┤玷F氰化鉀、過氧化氫、高錳酸鉀、高碘酸鉀、過硫酸鉀等可將Luminol氧化使其處于激發(fā)態(tài)，隨后回到基態(tài)時(shí)發(fā)出最大發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm的光。由于CRET不需要外部光源激發(fā)，由外部光源激發(fā)非特異性的背景可大大減少，有效地提高了分析的靈敏度。當(dāng)前，CRET在分析生物大分子和小分子時(shí)主要采用分子內(nèi)和分子間兩種能量轉(zhuǎn)移模式[63，64]。

雖然CRET現(xiàn)象在很早以前就為分析科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，但由于CRET有限的能量供受體對(duì)選擇，能量轉(zhuǎn)移效率低下，其應(yīng)用并不多。Zhao等[64]在微流控系統(tǒng)中引入了CRET用于改善免疫分析的靈敏度，以N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)標(biāo)記雌二醇(E2)抗原為示蹤劑，與E2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量的FITC標(biāo)記抗體，并通過CL光譜對(duì)該體系的發(fā)光行為進(jìn)行表征，證實(shí)該CL體系為免疫CRET轉(zhuǎn)移，將該免疫體系與微流控芯片電泳-化學(xué)發(fā)光(MCE-CL)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合進(jìn)行分析，游離的ABEI標(biāo)記抗原和免疫復(fù)合物在60 s內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離，E2的檢測(cè)限達(dá)到了3.6×10-11mol/L。Zhang等[65]用Luminol-H2O2-HRP和熒光素(Fluorescein)作為CRET供體-受體對(duì)，結(jié)合核酸適體特異性識(shí)別靶分子，巧妙設(shè)計(jì)了二元、三元DNA分子信標(biāo)作為信號(hào)探測(cè)器檢測(cè)小分子三磷酸腺苷(ATP)。用二元、三元DNA分子信標(biāo)檢測(cè)ATP的檢出限分別達(dá)到1.1×10-7、3.2×10-7mol/L。該方法成功檢測(cè)了白血病細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的ATP，具有樣品消耗量少、分析速度快、靈敏度高及選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。選擇不同的核酸適體，可進(jìn)一步擴(kuò)展該方法在高通量藥物篩選、臨床診斷、細(xì)胞研究等方面的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的CRET主要使用小分子熒光染料作為能量受體，由于小的斯托克斯位移差異，使得供受體對(duì)的發(fā)射光譜容易發(fā)生重疊，CRET的轉(zhuǎn)移效率低。近期，使用一些納米材料(如QDs，AuNPs，石墨烯等)作為能量受體，由于其具有大的斯托克斯位移和高的能量轉(zhuǎn)移效率，使CRET得到了極大地發(fā)展。

QDs相對(duì)于有機(jī)熒光團(tuán)具有更長(zhǎng)的的激發(fā)壽命，能否將QDs作為共振能量轉(zhuǎn)移的受體，有機(jī)熒光團(tuán)作為供體產(chǎn)生共振能量轉(zhuǎn)移引起人們的關(guān)注[66]。由于QDs具有寬的激發(fā)光譜，高的量子產(chǎn)率，無疑能有效的作為CRET的能量受體。2006年，Huang等[67]首次建立了基于QDs的CRET分析方法。他們研究了QDs催化Luminol-H2O2-HRP-PIP的CL體系，以QDs作為能量受體，Luminol的化學(xué)發(fā)光為能量供體，提出了該催化體系的CL反應(yīng)機(jī)理為化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移。由于Huang等的開拓性工作，此后CRET的研究日益受到人們的關(guān)注[68，69]。Zhao 等[70]提出了Luminol-NaBrO-QDs的非酶CRET體系，大大地拓寬了CRET的應(yīng)用范圍。他們以Luminol-NaBrO作為能量供體，CdTe -QDs為能量受體，系統(tǒng)地分析比較了該體系，并結(jié)合MCE-CL技術(shù)，基于多種生理活性物質(zhì)對(duì)該體系的抑制作用實(shí)現(xiàn)對(duì)其分析測(cè)定。Willner等[71]以DNAzyme催化的Luminol-H2O2發(fā)光的體系作為能量供體，CdSe/ZnS-QDs作為能量受體，分別建立了檢測(cè)核酸適配體和DNA的CRET分析平臺(tái)。

相對(duì)其它的納米材料，AuNPs具有很多優(yōu)勢(shì)，如無毒、良好的生物兼容性，易于合成和表面功能化和高的摩爾吸光系數(shù)等。使用AuNPs高的猝滅效率，更長(zhǎng)的供受體距離，在FRET系統(tǒng)中已被廣泛應(yīng)用[72]，也逐漸應(yīng)用于構(gòu)建CRET系統(tǒng)。最近，Huang等[73]提出了一種基于AuNPs的長(zhǎng)距離三明治夾心法檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)的方法。他們使用AuNPs標(biāo)記Anti-AFP-1作為能量受體，HRP共軛連接Anti-AFP-2，結(jié)合Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系作為CL供體，當(dāng)分析物AFP存在時(shí)，發(fā)生免疫反應(yīng)，使供受體之間的距離靠近，發(fā)生CRET。基于該分析原理，高靈敏、高選擇性地測(cè)定了AFP。在石墨烯(Graphene)或它的水溶性衍生物氧化石墨烯(GO)反應(yīng)體系中，由于CL供體到石墨烯或GO的π共軛系統(tǒng)可產(chǎn)生非輻射電子轉(zhuǎn)移，與AuNPs一樣，已被廣泛用作CRET的有效猝滅劑。Bi等[74]使用GO與生物分子直接作用建立了CRET用于生物大分子的檢測(cè)，先用熒光染料標(biāo)記的目標(biāo)ssDNA(FAM-ssDNA)吸附在GO表面作為能量受體，Luminol-H2O2產(chǎn)生CL，作為能量供體，高靈敏和高選擇性地檢測(cè)了H1V1 DNA和凝血酶。Lee等[75]使用石墨烯作為能量受體，Luminol-H2O2-HRP作為能量供體，構(gòu)建了均相免疫的CRET用于C-反應(yīng)蛋白(CRP)的檢測(cè)。當(dāng)前，CRET的進(jìn)一步應(yīng)用有賴于開發(fā)新的CL試劑提高CRET的靈敏度和擴(kuò)大其潛在的應(yīng)用。我們相信，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，開發(fā)出更多新的CRET供受體對(duì)，可以擴(kuò)展其在生命科學(xué)中的重要應(yīng)用。

4 展望

選擇合適的供受體對(duì)，是RET得以實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵。人們對(duì)FRET的研究從早期的兩個(gè)熒光基團(tuán)之間，逐漸擴(kuò)展到納米材料與熒光基團(tuán)之間，除了應(yīng)用于生物化學(xué)的分析，人們也用FRET探索或驗(yàn)證晶體的結(jié)構(gòu)等。隨著QDs的出現(xiàn)，BRET的應(yīng)用研究正在不斷發(fā)展。而CRET的研究的不斷深入，解決了FRET自身熒光干擾和熒光壽命短等問題，進(jìn)一步拓寬了能量轉(zhuǎn)移的應(yīng)用。由此可見，各種能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在不同的領(lǐng)域均有其獨(dú)特的應(yīng)用，在生命科學(xué)研究中，使用哪一種RET，主要取決于實(shí)際分析的需要。此外，開發(fā)新型的RET供受體對(duì)是進(jìn)一步推動(dòng)RET用于生命科學(xué)，如臨床癌癥標(biāo)記物的檢測(cè)、小分子間距離的研究等熱門研究課題。在此基礎(chǔ)上，相信RET會(huì)在生物分子結(jié)構(gòu)分析、生物標(biāo)志物的測(cè)量以及臨床疾病的診斷等生物科學(xué)領(lǐng)域作出更大的貢獻(xiàn)。