毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺增效減毒作用的研究

馮巧巧，劉軍田，馬玉奎

(1. 山東省食品藥品監(jiān)督管理局審評認(rèn)證中心，山東 濟(jì)南 250013; 2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

1 引 言

毛蚶(Arca Subcrenata Lischke)最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，俗稱毛蛤、麻蛤， 屬軟體動物門、雙殼綱、列齒目、蚶科，主要分布于中國、朝鮮和日本沿海[1]。毛蚶的營養(yǎng)與藥用價值較高，其殼和肉皆有藥用價值。毛蚶提取物是由毛蚶肉經(jīng)低溫提取純化加工制成，其主要藥效成分為毛蚶多糖、毛蚶多肽和毛蚶核酸，具有“溫中健胃、益氣補(bǔ)血、破結(jié)消痰”之功。本研究采用腹水型S180小鼠和免疫低下小鼠模型，初步考察了毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的增效減毒以及對免疫低下小鼠的非特異性免疫能力的作用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1動物 昆明種小鼠(SCXK(京)2007-0001)，雌雄兼用，體重18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

2.1.2藥品與試劑 毛蚶提取物(山東省中醫(yī)藥研究院提供，批號100805)；注射用環(huán)磷酰胺(CTX，山西仟源制藥有限公司提供，批號：1011355)；印度墨汁(北京篤信精細(xì)制劑廠提供，批號：0101102)。

2.1.3儀器 Sysmex XT-2000IV型全自動血球計數(shù)儀(Sysmex Corporation)；MC00000539型721分光光度計(上海申化儀表自控公司)；Victor 1420多標(biāo)記檢測儀(美國PerkinElmer公司)；JY2001型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2.2 方法

2.2.1對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用[2]抽取腹水型S180小鼠種瘤后6 d內(nèi)的腹水，以生理鹽水稀釋后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.0×107～3.0×107個/ml，分別接種于小鼠右側(cè)腋部皮下，每只0.2 ml。將接種后的小鼠隨機(jī)分為以下8個試驗組：分別為陰性對照組、單用CTX組、CTX+毛蚶提取物400 mg·kg-1、CTX+毛蚶提取物200 mg·kg-1、CTX+毛蚶提取物100 mg·kg-13個劑量組和單用毛蚶提取物400、200、100 mg·kg-13個劑量組。于接種次日給藥，毛蚶提取物灌胃給藥，給藥容積為20 ml·kg-1，陰性對照組給予等容積蒸餾水。給予毛蚶提取物第9 d，除陰性對照組和單用毛蚶提取物組外，其余各鼠均靜脈注射CTX 50 mg/kg，連續(xù)3 d。末次給予毛蚶提取物1 h后，除單用毛蚶提取物組外，其余所有動物眶靜脈采血，于全自動血球計數(shù)儀測血白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)數(shù)量。所有動物處死后解剖瘤塊稱瘤重、體重，計算抑瘤率。

腫瘤抑制率=(C-T)/C×100%，T為給藥組平均瘤重，C為陰性對照組平均瘤重。得出抑瘤率后，以q值評定兩藥合用的療效。

q值=E(AB)/[EA+(1-EA) ×EB]，E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA 、EB為兩藥單用的抑制率，q=0.85～1.15表示兩藥作用相加，q>1.15表示兩藥作用協(xié)同，q<0.85表示兩藥作用拮抗。

2.2.2毛蚶提取物對小鼠巨細(xì)胞吞噬功能的影響[3]取體重18～22 g的昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組：正常對照組、模型組、毛蚶提取物400、200、100 mg·kg-13個劑量組，每組10只。各組分別灌胃給予不同濃度的藥物，給藥容積為20 ml·kg-1，正常對照和模型組給予等容積蒸餾水，每天給藥1次，連續(xù)14 d。 于給藥第7、9和11 d除正常對照組外，各組小鼠腹腔注射CTX 50 mg/kg造模。末次給藥后1 h，以0.2 mL/20g體重尾靜脈注射25%(v/v)印度墨汁。分別于注射墨汁后2、10 min從眶靜脈叢取血20 μL，加入到2 ml 0.1% Na2CO3溶液中，680 nm波長測其光密度(OD值)，解剖動物取肝臟、脾臟稱重，計算廓清指數(shù)。

計算公式：廓清指數(shù)K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)，計算廓清指數(shù)(K)及校正廓清指數(shù)(α)。校正廓清指數(shù)α=K1/3×體重/(肝重+脾重) 。K：直線斜率，可表示吞噬速率；α：反映每單位組織重量的吞噬活性。

2.2.3毛蚶提取物對小鼠血清溶血素水平的影響[3]取體重18～22 g的昆明種小鼠60只，分組與給藥劑量同2.2.2。給藥5次后，除正常對照組外，其余各組腹腔注射20%兔紅細(xì)胞生理鹽水0.2 ml進(jìn)行免疫，免疫后繼續(xù)給藥8 d。免疫后第2、4、6 d除正常對照組外，其余小鼠腹腔注射CTX 30 mg/kg造模。于末次給藥1 h后，眶靜脈采血制備血清，處死小鼠后取脾臟及胸腺稱重，計算其指數(shù)。臟器指數(shù)=[臟器重量(g)/小鼠體重(g)]×100。將小鼠血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1 ml，與20%兔紅細(xì)胞懸液0.5 ml、10%補(bǔ)體0.5 ml混勻，置37℃水浴中保溫30 min，0℃終止反應(yīng)，離心后取上清，于Victor 1420多標(biāo)記檢測儀540 nm處測OD值。

3 結(jié)果

3.1 毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的增效作用

與陰性對照組比較，環(huán)磷酰胺和毛蚶提取物合用后對腫瘤的抑制率明顯高于單用環(huán)磷酰胺或者單用毛蚶提取物，其中環(huán)磷酰胺和毛蚶提取物200、400 mg·kg-1合用后q值大于0.85，具有明顯的協(xié)同作用，說明毛蚶提取物在200 mg·kg-1劑量以上對環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用具有明顯的增強(qiáng)效果。見表1。

3.2 毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的減毒作用

與陰性對照組比較，環(huán)磷酰胺可明顯減少模型小鼠的白細(xì)胞數(shù)量，而與毛蚶提取物合用后，白細(xì)胞數(shù)量與單用環(huán)磷酰胺比較明顯升高，400和200 mg·kg-1劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，各個劑量組對血小板數(shù)量無明顯影響。見表2。

表1 毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺抑瘤率的增效作用

注：*P<0.05, **P<0.01, vs模型組

表2 毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的減毒作用

注：*P<0.05, **P0.01, vs模型組

3.3 毛蚶提取物對小鼠巨細(xì)胞吞噬功能的影響

模型組與正常對照組比較，吞噬指數(shù)和校正廓清指數(shù)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，說明造模成功。毛蚶提取物200、400 mg·kg-1劑量組碳粒廓清指數(shù)和校正廓清指數(shù)與模型組比較明顯提高(P<0.05)，提示毛蚶提取物200 mg·kg-1以上劑量可明顯提高免疫低下小鼠單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)果見表3。

3.4 毛蚶提取物對小鼠溶血素水平的影響

小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，胸腺和脾臟指數(shù)均明顯低于正常對照組(P<0.05)，顯示動物呈免疫抑制狀態(tài)，證明造模成功。毛蚶提取物200、400 mg·kg-1劑量組OD值、胸腺和脾臟指數(shù)均明顯高于模型組(P<0.05)，說明毛蚶提取物200 mg·kg-1以上劑量可明顯提高免疫低下小鼠的免疫功能。見表4。

表3 毛蚶提取物對免疫低下小鼠碳廓清速率的影響

注：#P﹤0.05, # #P<0.01, vs正常對照組；*P<0.05, vs模型組

表4 海生素對小鼠溶血素水平、胸腺和脾臟系數(shù)的影響

#P<0.05, # #P<0.01, vs正常對照組；*P<0.05, vs模型組

4 討論

惡性腫瘤是全球最大的公共衛(wèi)生問題之一，全球每年新增癌癥患者1 500多萬人，隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化和人口老齡化進(jìn)程的加快，不良生活方式和環(huán)境污染等問題，我國癌癥發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢，惡性腫瘤的防治形勢越來越嚴(yán)峻[4]。目前治療腫瘤的主要方法是手術(shù)、放化療以及生物免疫治療等，其中化療是西醫(yī)最常見的治療方法，但是目前臨床上所有的化療藥物安全治療窗比較小，治療腫瘤的同時會帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且很容易出現(xiàn)耐藥性，長期用藥患者耐受性差，治療效果不理想。如何提高化療藥物的治療效果，降低不良反應(yīng)是臨床上亟待解決的問題，而中醫(yī)藥在這方面發(fā)揮了良好的作用。一般中藥單用抗腫瘤效果較差，但可通過扶正培本和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等起到輔助抗腫瘤作用。

多種海洋生物均具有抗腫瘤活性，其中海洋貝類是目前開發(fā)研究的熱點，毛蚶多糖和毛蚶多肽是毛蚶提取物中的主要生物活性成分，具有降血糖、降血脂、護(hù)肝、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[5-7]。本研究采用腹水型S180小鼠和免疫低下小鼠模型為實驗對象，以其抑瘤率、白細(xì)胞、巨細(xì)胞吞噬功能、溶血素水平和胸腺、脾臟指數(shù)為指標(biāo)，初步評價了毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用以及對免疫功能的影響。研究結(jié)果顯示，毛蚶提取物與環(huán)磷酰胺合用后可明顯提高環(huán)磷酰胺對S180肉瘤的抑制效果，具有明顯的增效作用，同時合用后模型小鼠白細(xì)胞減少程度顯著降低，具有明顯的減毒作用。免疫學(xué)初步試驗結(jié)果提示，毛蚶提取物可明顯提高環(huán)磷酰胺免疫低下小鼠的非特異性免疫能力，說明毛蚶提取物對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用與其免疫調(diào)節(jié)能力有關(guān)。