甘草對(duì)大鼠應(yīng)激性潰瘍及多胺影響的研究

趙世清， 李茹柳， 年立全， 陶玉珠， 曾 丹， 陳蔚文

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東　廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東　廣州　510405）

甘草對(duì)大鼠應(yīng)激性潰瘍及多胺影響的研究

趙世清1， 李茹柳2*， 年立全2， 陶玉珠2， 曾 丹2， 陳蔚文2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405）

目的 探討益氣健脾中藥甘草修復(fù)胃腸黏膜損傷的療效機(jī)制。方法 建立定量檢測(cè)胃腸黏膜中多胺的柱前衍生-高效液相色譜法；并在大鼠水浸-束縛應(yīng)激性潰瘍模型上，觀察甘草水提物對(duì)胃腸黏膜損傷及多胺的影響。結(jié)果 建立了檢測(cè)胃和小腸黏膜中多胺（包括腐胺、精脒和精胺）的方法；甘草水提物能減輕應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜損傷，減輕胃組織病理?yè)p害，提高胃黏膜多胺水平。結(jié)論 甘草水提物修復(fù)胃腸黏膜損傷的作用機(jī)制，可能與其影響多胺及其信號(hào)通路有關(guān)。

甘草；應(yīng)激性潰瘍；多胺

胃腸黏膜損傷是臨床常見(jiàn)的病理改變，研究表明多胺在胃腸黏膜損傷修復(fù)中起重要作用，多胺的調(diào)控是眾多信號(hào)傳遞路徑的焦點(diǎn)［1-3］。胃腸黏膜保護(hù)是益氣健脾中藥的作用機(jī)理之一，本課題組在對(duì)小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）的研究中發(fā)現(xiàn)，益氣健脾中藥黃芪、白術(shù)、黨參、甘草提取物對(duì)胃腸黏膜損傷修復(fù)的幾個(gè)環(huán)節(jié)如細(xì)胞增殖、遷移、分化有促進(jìn)作用［4-7］，作用機(jī)制與其影響多胺調(diào)控信號(hào)通路有關(guān)［8-11］，并在IEC-6細(xì)胞建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)多胺（腐胺、精脒、精胺）的方法［12］，為了進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平研究益氣健脾中藥胃腸黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)胃腸黏膜多胺的方法。選擇大鼠應(yīng)激性潰瘍作為胃腸黏膜損傷模型，以益氣健脾中藥甘草作為治療藥物，考察胃腸黏膜多胺檢測(cè)方法的可行性、藥物對(duì)胃腸黏膜損傷修復(fù)過(guò)程多胺的影響，以探討益氣健脾中藥胃腸黏膜保護(hù)的療效機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物及試劑 甘草藥材為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室童家赟講師鑒定。提取方法：甘草藥材加10倍量水浸泡30 min，熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮，冷凍干燥得甘草水提物（1 g提取物相當(dāng)于3 g藥材）。臨用時(shí)用蒸餾水配成所需濃度。實(shí)驗(yàn)劑量以藥材質(zhì)量計(jì)算。

腐胺對(duì)照品（CAS.No.110-60-1，相對(duì)分子質(zhì)量88.15，Sigma公司）；精脒對(duì)照品（CAS.No.124-20-9，相對(duì)分子質(zhì)量145.25，Sigma公司）；精胺對(duì)照品（CAS. No.71-44-3，相對(duì)分子質(zhì)量202.34，Sigma公司）；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）（批號(hào)AF-100-15，Peprotech公司）；考馬斯亮藍(lán)試劑盒（批號(hào)201110813，南京建成生物工程研究所）；色譜甲醇（德國(guó)MERCK公司）；高氯酸、苯甲酰氯、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯甲烷均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌性，200～220 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）2008-0002。

1.3儀器 Agilent1200液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent科技有限公司）；Hypersil ODS2液相色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；島津AUW120D分析天平（日本島津公司）；UVmini-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（蘇州島津公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1柱前衍生-高效液相色譜法建立多胺檢測(cè)方法［12］

2.1.1多胺對(duì)照品溶液配制 分別精密稱(chēng)取腐胺、精脒、精胺對(duì)照品0.015 05 g、0.019 20 g、0.016 56 g，各加色譜甲醇溶解定容至5 mL，分別得濃度為3.41×10-2mol/L、2.64×10-2mol/L、1.64×10-2mol/L的腐胺、精脒、精胺的單一對(duì)照品貯備液，吸取上述對(duì)照品貯備液（腐胺15μL、精脒60μL、精胺60μL）加入5 mL量瓶中，再加色譜甲醇稀釋至刻度，得腐胺、精脒、精胺分別為1.02× 10-4mol/L、3.17×10-4mol/L、1.96×10-4mol/L的對(duì)照品混合液。

2.1.2衍生化處理 取多胺對(duì)照品混合溶液1.0 mL，分別加入2 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL、苯甲酰氯8μL，渦旋混合后放置20 min，再依次加入飽和氯化鈉溶液2.0 mL、三氯甲烷2.0 mL，渦旋混合1 min，3 000 r/min離心10 min，吸取下層1.5 mL有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?.5 mL的流動(dòng)相（甲醇-水為55∶45）溶解在帶螺蓋的玻璃管中，50℃水浴放置8 h，所得溶液分別加2 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL和三氯甲烷2.0 mL，渦旋混合1 min，3 000 r/min離心10 min，吸取下層1.5 mL有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.5 mL流動(dòng)相溶解。進(jìn)樣前用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.1.3色譜條件 Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，Hypersil ODS2液相色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)234 nm；柱溫25℃；流動(dòng)相為甲醇-水（55∶45），體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20μL。

2.1.4線性關(guān)系考察 上述處理好的對(duì)照品衍生物溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10、15、20、25μL測(cè)定，以衍生化前對(duì)照品溶液中多胺的濃度折算進(jìn)樣量（μmol）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.2大鼠應(yīng)激性潰瘍模型及黏膜多胺測(cè)定

2.2.1大鼠應(yīng)激性潰瘍模型 正常組大鼠不造模，其他大鼠分為模型組、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）組、甘草水提物高劑量和低劑量組。大鼠禁食不禁水24 h，模型組以蒸餾水10 mL/kg灌胃，陽(yáng)性對(duì)照藥組皮下注射EGF（100μg/kg）并以蒸餾水10 mL/kg灌胃，受試藥組以甘草水提物灌胃（分別為15 g/kg和7.5 g/kg）。大鼠給藥30 min后裝入特制的固定鼠籠，大鼠頭朝上放置于（19±1）℃水中，浸泡至大鼠胸部劍突水平，6 h后頸椎脫臼處死，立即取出胃腸組織。胃組織沿胃大彎剪開(kāi)，另從幽門(mén)下5 cm起剪取15 cm小腸組織并剪開(kāi)，冰凍生理鹽水沖洗胃腸內(nèi)容物后，平鋪展平，拍照，觀察胃黏膜損傷程度，計(jì)算潰瘍指數(shù)。然后冰上刮取胃黏膜和小腸黏膜，-80℃保存，待檢測(cè)黏膜多胺含有量。

2.2.2潰瘍指數(shù)計(jì)算 肉眼觀察腺胃部黏膜損傷程度，計(jì)算黏膜潰瘍指數(shù)，參照Guth標(biāo)準(zhǔn)［13］：胃黏膜糜爛、潰瘍、出血等長(zhǎng)度累計(jì)積分，正常為0分，斑點(diǎn)糜爛計(jì)1分，糜爛長(zhǎng)度＜1 mm計(jì)2分，1～2 mm計(jì)3分，3～4mm計(jì)4分，＞4 mm計(jì)5分，各分值相加即為該大鼠潰瘍指數(shù)。

2.2.3病理組織學(xué)分析 取胃竇組織石蠟包埋，切片，HE染色后光鏡下觀察。

2.2.4黏膜中蛋白的測(cè)定 作為黏膜多胺定量檢測(cè)的計(jì)算步驟之一，需檢測(cè)黏膜蛋白量。從低溫冰箱取出待測(cè)的黏膜樣本，稱(chēng)取胃或小腸黏膜各樣本適量，分別加2.0 mL生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10min，取上清液0.5mL加生理鹽水2.0 mL混勻，取0.05 mL加考馬斯亮藍(lán)試劑稀釋液3 mL，混勻，靜置5 min后于分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水做空白對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)蛋白做隨行對(duì)照，并計(jì)算樣品中蛋白的含有量。

蛋白質(zhì)量濃度（g/L）=［（測(cè)定管OD值-空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）］×標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度（0.563 g/L）。

蛋白含有量（mg/g）=黏膜中測(cè)得的蛋白量/稱(chēng)取的黏膜質(zhì)量。

2.2.5黏膜多胺的衍生化處理 稱(chēng)取胃或小腸黏膜各樣本適量，分別加5%冷高氯酸溶液1.5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。取上清液1.0 mL進(jìn)行衍生化，方法同“2.1”項(xiàng)下所述。

多胺含有量（10-10mol/mg）=（測(cè)得黏膜中的多胺量/黏膜質(zhì)量）/對(duì)應(yīng)黏膜的蛋白含有量。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1黏膜多胺檢測(cè)

3.1.1檢測(cè)方法 按照本課題組以往建立的多胺對(duì)照品檢測(cè)方法［12］，可同時(shí)檢測(cè)到3種多胺（腐胺、精脒和精胺）對(duì)照品的單一峰，說(shuō)明在此實(shí)驗(yàn)條件下可檢測(cè)腐胺、精脒和精胺。見(jiàn)圖1。

圖1　多胺對(duì)照品高效液相色譜圖

3.1.2多胺對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線 以衍生化前對(duì)照品溶液中多胺的濃度折算進(jìn)樣量（μmol）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：腐胺y=215.0x-1.058，r2=0.999 99，線性范圍0.069～1.729μmol。精脒y= 19.61x-5.661，r2=0.999 98，線性范圍7.138～178.451 μmol。精胺y=12.31x-3.933，r2=0.999 99，線性范圍4.419～110.487μmol。線性范圍內(nèi)各樣品線性關(guān)系良好，為后續(xù)黏膜多胺測(cè)定提供了計(jì)算公式。

3.1.3正常大鼠小腸黏膜多胺測(cè)定 因大鼠小腸黏膜較易刮取得到，且小腸黏膜量比胃黏膜量充足，故黏膜多胺檢測(cè)方法建立用小腸黏膜進(jìn)行。由圖2可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)建立的柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)黏膜多胺，可分別檢測(cè)到腐胺、精脒、精胺的單一峰，表明用此方法可同時(shí)檢測(cè)黏膜的3種多胺。

圖2　正常大鼠小腸黏膜多胺的高效液相色譜圖

3.2甘草水提物對(duì)大鼠應(yīng)激性潰瘍及黏膜多胺的影響

3.2.1甘草水提物對(duì)大鼠潰瘍指數(shù)及病理組織學(xué)的影響表1可見(jiàn)，甘草水提物（15 g/kg）可降低應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)（與模型組比較P＜0.05），表明甘草水提物對(duì)胃黏膜損傷有治療作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

表1　甘草水提物對(duì)大鼠應(yīng)激性潰瘍的影響

由圖3可知，正常組胃黏膜組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整；模型組可見(jiàn)胃黏膜表面上皮細(xì)胞受損、脫落，形成多個(gè)大小、深淺不等的糜爛面，黏膜間質(zhì)明顯充血、水腫并伴有出血；EGF組和甘草高劑量組胃黏膜表面未見(jiàn)糜爛，間質(zhì)充血、水腫程度明顯較模型組輕；甘草低劑量組的改變介于模型組和高劑量組之間，可見(jiàn)少數(shù)糜爛。

圖3　甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠胃組織病理的影響（HE染色，×200）

3.2.2甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠黏膜多胺的影響 表2可見(jiàn)，EGF和甘草水提物可提高應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜精脒和精胺含有量，提示甘草水提物治療胃黏膜損傷的作用可能與其提高胃黏膜多胺含有量有關(guān)。因大鼠胃黏膜量本身較少，故刮取得到的胃黏膜量也少，難以達(dá)到腐胺的檢測(cè)限（腐胺與精脒、精胺相比含有量較少），故表2未列出腐胺檢測(cè)結(jié)果。

表2　甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜多胺的影響

表3可見(jiàn)，EGF和甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠小腸黏膜多胺無(wú)明顯影響。提示甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠黏膜多胺的影響主要在胃黏膜，對(duì)小腸黏膜多胺無(wú)明顯影響，可能與該模型病變主要在胃黏膜而不在小腸黏膜有關(guān)。

表3　甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠小腸黏膜內(nèi)多胺的影響

4　討論

應(yīng)激性潰瘍是臨床常見(jiàn)的胃腸黏膜損傷病變，胃腸黏膜損傷修復(fù)與多胺調(diào)控有重要關(guān)系［14］，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多胺合成的限速酶，研究表明應(yīng)激性潰瘍大鼠胃和十二指腸黏膜糜爛后，黏膜細(xì)胞遷移也依賴(lài)多胺合成，應(yīng)激后胃及十二指腸黏膜ODC活性明顯增加，而使用二氟甲基鳥(niǎo)氨酸（α-difluoromethylornithine，DFMO）后，抑制了ODC活性，則明顯抑制了胃腸黏膜的愈合［1］。還有研究表明，多胺釋放增加、給予表皮生長(zhǎng)因子等能促進(jìn)大鼠應(yīng)激性潰瘍愈合［2］。說(shuō)明多胺是胃腸黏膜損傷修復(fù)的重要影響因素。胃腸黏膜損傷修復(fù)是益氣健脾中藥的治療作用之一，因此對(duì)多胺含有量的影響可能是益氣健脾中藥胃腸黏膜保護(hù)的作用機(jī)制之一。

甘草性味甘平，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功能，臨床用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性等［15］。甘草是常用的益氣健脾中藥，也是益氣健脾著名方劑四君子湯、補(bǔ)中益氣湯、參苓白術(shù)散、小建中湯等的組成藥物。本實(shí)驗(yàn)室在小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）的實(shí)驗(yàn)研究表明，甘草提取物有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用［16］，甘草黃酮部位、甘草糖提取物有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用［6，8］，甘草糖提取物、甘草黃酮提取物促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與其影響多胺調(diào)控信號(hào)通路有關(guān)［8，17］。還有研究表明，甘草對(duì)消化道黏膜和細(xì)胞保護(hù)作用的分子藥理機(jī)制，與其影響細(xì)胞增殖與凋亡有關(guān)［18］。甘草酸可防護(hù)小腸上皮細(xì)胞DNA損傷，其機(jī)制可能與其上調(diào)P53、Gaad45α表達(dá)有關(guān)［19］。

本實(shí)驗(yàn)室前期建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)小腸上皮IEC-6細(xì)胞多胺（腐胺、精脒和精胺）的方法［12］，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上建立了胃腸黏膜多胺的檢測(cè)方法，并在大鼠水浸束縛應(yīng)激性潰瘍模型上，觀察甘草水提物對(duì)胃腸黏膜損傷及多胺的影響；結(jié)果表明，甘草水提物對(duì)應(yīng)激性潰瘍胃黏膜損傷有治療作用，能降低胃黏膜潰瘍指數(shù)，減輕胃組織病理?yè)p害，并能提高胃黏膜多胺含有量，提示甘草保護(hù)胃腸黏膜的作用與其影響多胺含有量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物上的研究結(jié)果，與本課題組在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)論相互印證，表明益氣健脾中藥胃腸黏膜保護(hù)作用的藥效機(jī)制與其影響多胺及其信號(hào)通路有關(guān)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0626-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.036

2014-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30772753，81173254）；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（財(cái)教［2013］338）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)特色重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（財(cái)教［2013］339）

趙世清（1986—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幚砗椭兴幓瘜W(xué)。E-mail：553439879@qq.com

李茹柳 Tel：（020）36585444，E-mail：lrl@gzucm.edu.cn