HPLC法同時測定金雞虎補(bǔ)丸中的去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素

陳海燕

（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西　南寧　530023）

HPLC法同時測定金雞虎補(bǔ)丸中的去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素

陳海燕

（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530023）

目的 建立HPLC法同時測定金雞虎補(bǔ)丸中去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素4種成分。方法 金雞虎補(bǔ)丸70%乙醇提取液的分析采用C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為乙腈-甲醇（3∶2），流動相B為0.1%H3PO4溶液，梯度洗脫；體積流量為0.9 m L/min；去氫二異丁香酚檢測波長為270 nm，五味子甲素、染料木素和芒柄花素均為254 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量20μL。結(jié)果 被測定的4組成分色譜峰均有良好的分離度，方法精密度、重復(fù)性的RSD均小于2.0%；在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定；各組分線性范圍較寬，線性關(guān)系良好（r≥0.999 4）；平均加樣回收率為96.8%～98.1%，RSD（n=6）≤1.4%。結(jié)論 金雞虎補(bǔ)丸的提取方法和流動相保證了分析方法的簡單易行、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠。

金雞虎補(bǔ)丸；去氫二異丁香酚；五味子甲素；染料木素；芒柄花素；黑老虎根；雞血藤

金雞虎補(bǔ)丸是部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥處方制劑第一冊所收載的品種，由黑老虎根、雞血藤、狗脊、牛大力、骨碎補(bǔ)、大棗、桑寄生（鹽酒制）、金櫻子（鹽制）、千斤拔等九味中藥加工制成，除去包衣顯棕色；味甘，微苦澀。具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)、健腎固精之功效，對水氣凝滯、四肢麻痹、腰膝酸痛、夜尿頻數(shù)、夢遺滑精等癥狀的治療效果明顯。目前，部頒標(biāo)準(zhǔn)僅對該制劑進(jìn)行了簡單的顯微和顯色鑒別，沒有對處方中所含藥物的任何成分進(jìn)行定量分析，很難有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效［1-2］。黑老虎根和雞血藤為處方中的主要藥物，去氫二異丁香酚和五味子甲素為黑老虎根的主要成分，芒柄花素和染料木素為雞血藤的專屬性成分，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫法同時對金雞虎補(bǔ)丸中的去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素［3］和芒柄花素［3］進(jìn)行定量測定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、G1311A四元泵、G1330B自動進(jìn)樣器恒溫器、G1322A脫氣機(jī)、G1315B可變波長檢測器、Chemstation色譜工作站；XP205型梅特勒電子天平（精度0.01 mg）。

1.2試藥與試劑 去氫二異丁香酚對照品（批號111838-201102，純度99.4%）、五味子甲素對照品（批號110764-201312，純度99.6%）、染料木素（批號111704-201302，純度99.1%）、芒柄花素（批號111703-200603，純度100%）均購于中國食品藥品檢定研究院；金雞虎補(bǔ)丸（水蜜丸，每瓶裝60 g；批號分別為201401003、201401004、201401008）購于李時珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑二廠）。

2　試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件 依利特C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動相A為乙腈-甲醇（3∶2），流動相B為0.1%H3PO4溶液［4-10］，梯度洗脫（0～8 min，75.0%A；8～21 min，75.0%→60.0%A；21～43 min，60.0%A；43～50 min，60.0%→75.0%A）；檢測波長（0～16 min，λ1=270 nm［11-13］；16～50 min，λ2=254 nm［14-15］）；體積流量0.9 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量20μL。此系統(tǒng)條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素計(jì)均不得低于3 000，分離度均大于1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液配制 精密稱取去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素4種對照品各適量，分別置于4個20 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，配制得去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素質(zhì)量濃度分別為1.025、0.698、0.530、0.595 mg/mL的對照品貯備溶液。再分別精密吸取上述對照品貯備溶液8、5、1、6mL置于同一個50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素與芒柄花素質(zhì)量濃度分別為0.164 0、0.069 8、0.010 6、0.071 4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品適量，除去包衣，研細(xì)，混勻，取5.0 g，精密稱定，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按金雞虎補(bǔ)丸處方比例稱取除黑老虎根的其余藥味和除雞血藤的其余藥味各一份，按金雞虎補(bǔ)丸的制備工藝分別制成黑老虎根空白樣品和雞血藤空白樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成黑老虎根空白溶液和雞血藤空白溶液。

2.3專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、黑老虎根空白溶液及雞血藤空白溶液各20μL，進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。供試品溶液中各待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，而空白溶液色譜圖在相應(yīng)位置處未見色譜峰。

2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各對照品貯備溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置于5個10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，以峰面積Y與對照品質(zhì)量濃度X線性回歸，得去氫二異丁香酚回歸方程為：Y=2.036 1× 104X-311.7，r=0.999 9，線性范圍為10.25～205.00μg/mL；五味子甲素Y=5.974 2×103X+ 233.5，r=0.999 4，線性范圍為6.98～139.60 μg/mL；染料木素Y=8.286 4×103X+307.7，r= 0.999 5，線性范圍為5.30～106.00μg/mL；芒柄花素Y=1.276 5×104X-501.4，r=0.999 7，線性范圍為5.95～119.00μg/mL。結(jié)果表明：去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素在各自的線性范圍內(nèi)，所測組分質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測得4種成分的峰面積，計(jì)算各成分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素RSD分別為0.6%、0.8%、0.9%、0.4%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

圖1　去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的HPLCFig.1 HPLC of dehydrodiisoeμgenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測定，記錄各組分峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的RSD分別為0.5%、0.8%、0.7%和0.4%。表明本法測定重復(fù)性良好。

2.7溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次進(jìn)樣20μL，測定其峰面積值，結(jié)果去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的RSD分別為0.7%、1.0%、0.8%、0.6%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批金雞虎補(bǔ)丸（去氫二異丁香酚為1.569 mg/g、五味子甲素為0.681 mg/g，染料木素為0.132 mg/g，芒柄花素為0.716 mg/g）2.5 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液25 mL、70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲波超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9樣品測定 取3個批號的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定本品中去氫二異丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素，結(jié)果見表2。

表2　樣品測定結(jié)果（mg·g-1，±s，n=3）Tab.2 Results of content determ ination（mg·g-1，± s，n=3）

表2　樣品測定結(jié)果（mg·g-1，±s，n=3）Tab.2 Results of content determ ination（mg·g-1，± s，n=3）

批號去氫二異丁香酚五味子甲素染料木素芒柄花素201401003 1.569±0.012 0.681±0.005 0.132±0.001 0.716±0.007 201401004 1.572±0.016 0.697±0.007 0.129±0.001 0.707±0.004 201401008 1.491±0.009 0.674±0.003 0.141±0.001 0.725±0.006

3　討論

3.1色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了流動相乙腈-0.1%H3PO4溶液、甲醇-0.1%H3PO4溶液、乙腈-甲醇（3∶2）與0.1%H3PO4溶液不同比例進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果以乙腈-0.1%H3PO4溶液為流動相梯度洗脫時染料木素和芒柄花素峰型對稱，但五味子甲素與前一峰達(dá)不到分離；以甲醇-0.1%H3PO4溶液為流動相梯度洗脫時染料木素峰型不對稱，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；而以乙腈-甲醇（3∶2）與0.1%H3PO4溶液不同比例進(jìn)行梯度洗脫時，所測4個組分均能達(dá)到基線分離，各組分峰型對稱。

3.2超聲提取時間的選擇 在供試品制備過程中，曾分別考察超聲提取10 min、30 min、60 min，結(jié)果表明超聲提取30 min和超聲提取60 min，所測得各組分的量差別不大，而超聲提取10 min所測得成分量明顯較低。故選取超聲提取30 min作為供試品制備的超聲提取時間。

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Determ ination of dehydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin in Jinji Hubu Pills by HPLC

CHEN Hai-yan
（Guangxi Medical College，Nanning 530023，China）

AIM To develop an HPLC method for simultaneously determining four components，such as dehydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin in Jinji Hubu Pills.METHODS The chromatograhic separation of 70%ethanolic extract of Jinji Hubu Pillswas performed on C18column（200mm×4.6 mm，5μm）.Mobile phase consisted of acetonitrile-methanol（3∶2）（A）and 0.1%phosphoric acid solution（B）were adopted at the flow rate of0.9mL/min.The detection wavelengthswere 270 nm for dehydrodiisoeugenol，254 nm for deoxyschizandrin，genistein and formononetin，respectively.The column temperaturewas35℃.The injection volume was 20μL.RESULTS The four compoundswere well separated.The RSD values of precision and reproducibility were all less than 2%.The stability was good in 24 h.The linear relationship between the concentration and peak areas of the four compoundswas all greater than 0.999 4.The recoveries were 96.8%-98.1% and RSD（n=6）less than 1.4%.CONCLUSION The developed extraction and mobile phase were simple，sensitive，accurate，and reproducible for Jinji Hubu Pills.

JinjiHubu Pills；dehydrodiisoeugenol；deoxyschizandrin；genistein；formononetin；rootof Kadsurae Coccineae；Spatholobi caulis

R927.2

A

1001-1528（2015）03-0538-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.017

2014-07-27

陳海燕（1971—），女，碩士，講師，主要從事藥物檢驗(yàn)分析和藥物化學(xué)教研工作。Tel：（0771）5323196，E-mail：chenhaiyanlunwen@163.com