長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯分析方法研究進(jìn)展

吳 琳， 魏 芳， 呂 昕， 董緒燕， 陳 洪

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062)

1 前言

長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Long-chain Polyunsaturated Fatty Acids，LC-PUFAs)是指分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上不飽和雙鍵，且碳鏈長(zhǎng)度為18～22個(gè)C的脂肪酸，主要有亞油酸(Leinoleic Acid，LA)、亞麻酸(Linolenic Acid，LnA)、二十碳四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)。其中，ARA、EPA及DHA在預(yù)防心血管疾病、降血脂、降低膽固醇、減肥等方面具有明顯的作用，是大腦、眼睛和整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常功能必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)人體健康非常重要[1,2]。脂肪酸根據(jù)第一個(gè)雙鍵距離甲基端位置的不同，可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列，攝入適量的ω-3系脂肪酸(如EPA、DHA)可預(yù)防心血管疾病，維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)健康，起到抗炎等作用；攝入ω-6系脂肪酸(如ARA)可以抑制腫瘤[3]。但攝入過(guò)多含DHA的油脂，可能會(huì)通過(guò)增強(qiáng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化的易感性，擾亂組織抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而給機(jī)體帶來(lái)不利的影響[4]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)于2000年按年齡段對(duì)膳食中ω-6/ω-3系脂肪酸的均衡比例給出了適合中國(guó)人的平衡建議：2歲以下和60歲以上是4∶1，其它年齡是4～6∶1[5]。因此，對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸進(jìn)行種類及雙鍵位置的鑒定對(duì)脂質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的研究具有重要意義。

甘油三酯(Triacylglycerols，TAGs)是脂肪酸最主要的存在形式，占食用油組成的95%以上。TAGs是由一個(gè)甘油分子與三個(gè)脂肪酸分子縮合而成，而脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的位置分布有兩類：sn-1/3(α)和sn-2(β)，脂肪酸在TAGs中的分布位置決定著油脂的功能特性及吸收代謝情況[6]。例如，Christensen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，EPA及DHA處于sn-2位比處于sn-3位的吸收利用要有效得多。已有關(guān)于LC-PUFAs在甘油三酯中位置分布的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，海豹油TAGs中，PUFAs主要分布在TAGs的α位，而魚油中多分布在β位[8 - 10]。因此，對(duì)LC-PUFAs TAGs中脂肪酸?；恢眠M(jìn)行剖析對(duì)于揭示LC-PUFAs 的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性有著重要的意義。

隨著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展，使得脂質(zhì)組成及其結(jié)構(gòu)的高效、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的分析與鑒定成為可能。但是在剖析LC-PUFAs TAGs時(shí)，除了缺少必要的標(biāo)準(zhǔn)品外，還存在其他困難。因此，需要更高效的色譜分離技術(shù)和新的質(zhì)譜鑒定技術(shù)的支持[11]。本文對(duì)LC-PUFAs及LC-PUFAs TAGs的色譜分離及質(zhì)譜鑒定方法進(jìn)行了綜述，包括直接進(jìn)樣質(zhì)譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的色譜分析技術(shù)

色譜技術(shù)可以快速、高效地實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的分離。常用于分離脂質(zhì)的色譜技術(shù)有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和超臨界流體色譜法等。而用于LC-PUFAs TAGs分離的方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。

2.1 薄層色譜

薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)具有操作簡(jiǎn)單，耗資少，省時(shí)的優(yōu)勢(shì)，常用于脂質(zhì)種類的分離。廣泛用于油脂分離的TLC固定相有硅膠、氧化鋁、硅藻土。近年來(lái)，一些新型材料作為TLC的固定相用于分離飽和度不同的脂肪酸甲酯。Amlund等[12]在對(duì)魚油脂肪酸和甲基汞相互作用的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，采用高效薄層色譜(HPTLC)分離魚油樣品，使用粒徑更小的硅膠作為固定相，得到含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。2012年，Dillon等[13]首次提出巰醇銀(AgTCM)作為TLC的固定相材料，AgTCM-TLC與傳統(tǒng)Ag-TLC都是根據(jù)固定相中的Ag+與雙鍵的π電子之間的相互作用來(lái)分離飽和度不同的化合物，但AgTCM對(duì)光穩(wěn)定性更強(qiáng)，薄層板壽命更長(zhǎng)，AgTCM-TLC已成功應(yīng)用于分離多種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甲酯混合物[14]。TLC法分析樣品中TAG時(shí)，首先使用合適的展開劑將樣品按照脂質(zhì)種類進(jìn)行分離；然后將TAG組分回收，再在含Ag+的硅膠板上根據(jù)TAG中羧酸基的飽和程度來(lái)進(jìn)一步分離。隨著TLC法與可見分光光度計(jì)的結(jié)合，使得TLC可以對(duì)TAG進(jìn)行定量分析。鮑方宇等[15]采用磷鉬酸作為顯色劑，通過(guò)TLC與可見分光光度計(jì)相結(jié)合的技術(shù)，準(zhǔn)確測(cè)定了混合脂肪酸組成的TAG含量，但由于該方法分離回收的效果受硅膠板的質(zhì)量、展開劑、顯色效果等因素的影響較大，因此一般只作為定性分析的一種輔助手段。

2.2 氣相色譜

2.2.1長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的氣相色譜分析方法氣相色譜(Gas Chromatography，GC)分析TAG時(shí)，在進(jìn)樣前，通常需要對(duì)TAG進(jìn)行甲酯化衍生，因而甘油三酯是否完全甲酯化是準(zhǔn)確分析油脂中脂肪酸的關(guān)鍵，而甲酯化衍生會(huì)導(dǎo)致TAG脂肪酸?；恢梅肿咏Y(jié)構(gòu)信息的丟失，因此GC法主要用于TAGs脂肪酸組成的分析[16]。目前，GC已用于魚油[17,18]、藻油[19]和微生物油脂中含LC-PUFAs TAGs的脂肪酸組成分析。2012年，Delmonte等[20]應(yīng)用新型陰離子氣相色譜毛細(xì)管柱SLB-IL111實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酸異構(gòu)體的分離，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，同時(shí)分離包括長(zhǎng)鏈在內(nèi)的多不飽和脂肪酸順?lè)串悩?gòu)體和雙鍵位置異構(gòu)體。Liu等[21]應(yīng)用GC-MS對(duì)小鼠視網(wǎng)膜中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸分析時(shí)，確定了ω-3/ω-6系脂肪酸的含量比。通過(guò)選擇不同的質(zhì)譜掃描模式，比較了碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵數(shù)及雙鍵位置對(duì)GC-MS分析脂肪酸的質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全掃描模式下，隨著脂肪酸不飽和度增高，質(zhì)譜響應(yīng)(峰面積)略微降低；而在選擇離子掃描模式時(shí)，響應(yīng)隨不飽和度增加而增加，脂肪酸雙鍵位置對(duì)響應(yīng)的影響不明顯。

2.2.2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的GC分析方法隨著高溫氣相色譜(HTGC)固定相的出現(xiàn)，氣相色譜分析高沸點(diǎn)化合物成為可能。在柱溫大于400 ℃的情況下，HTGC與MS聯(lián)用，不需要將TAG進(jìn)行甲酯化衍生，TAG按C數(shù)由小到大依次洗脫。但高溫對(duì)不飽和度相對(duì)較高的TAGs有破壞作用，因此不適合分析LC-PUFAs TAGs。Sutton等[22]使用HTGC聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)分離TAGs時(shí)，溫度達(dá)到430 ℃，具有相同碳鏈長(zhǎng)度的甘油酯及相同雙鍵數(shù)(DBs)的甘油酯出現(xiàn)共洗脫現(xiàn)象，說(shuō)明HTGC-MS無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)TAGs位置異構(gòu)體的鑒定[23]。

2.3 高效液相色譜

2.3.1非水反相液相色譜由于甘油三酯不溶于水，因此液相色譜常采用非水流動(dòng)相?；谑送榛I合硅膠固定相(商品化的C18色譜柱)的非水反相液相色譜(Non-aqueous Reversed Phase HPLC，NARP-HPLC)是分析TAG最常用的技術(shù)之一。甘油三酯在C18色譜柱中的保留取決于當(dāng)量碳數(shù)(Equivalent Carbon Number，ECN)，ECN等于甘油三酯中?；溈侰數(shù)(CNs)減去兩倍的雙鍵數(shù)(DBs)，即 ECN=CN-2DB。Momchilova等[24]使用End-capped Superspher RP-18(e)柱，流動(dòng)相為乙腈和乙醇，梯度洗脫，將PPL/PLP，PPLn/PLnP，PPE/PEP，PPA/PAP，PPD/PDP(其中P：C16∶0，L：C18∶2，Ln：C18∶3，E：C20∶5，A：C20∶4，D：C22∶6)完全分離。通過(guò)比較4種ODS色譜柱和6種流動(dòng)相對(duì)TAG保留的影響表明，脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵數(shù)及不飽和脂肪酸的?；恢檬怯绊懕Ａ魰r(shí)間的主要原因。Lisa等[25]分別使用C18色譜柱及C30色譜柱分離黑醋栗油中TAGs，比較了不同流動(dòng)相條件、洗脫梯度、柱溫對(duì)分離結(jié)果的影響。結(jié)果表明相同條件下，C18色譜柱及C30色譜柱分析黑醋栗油中TAG時(shí)，出峰時(shí)間區(qū)別不大，但是C30色譜柱的分離效果遠(yuǎn)沒(méi)有C18色譜柱的分離效果好，只能分離得到38種TAGs，而C18色譜柱可以分離得到83種TAGs；C30色譜柱與C18色譜柱相比，不能分離含α-亞麻酸和γ-亞麻酸的LC-PUFAs TAG雙鍵位置異構(gòu)體；柱溫不會(huì)改變C18色譜柱分離TAG的出峰順序，但可以改變C30色譜柱分離TAG的出峰順序；不同初始流動(dòng)相條件、不同洗脫梯度只會(huì)造成保留時(shí)間偏移，但不會(huì)影響TAG的出峰順序。

2.3.2Ag+液相色譜Ag+液相色譜(Ag-HPLC)是一種特殊的正相色譜，常作為NARP-HPLC分離的互補(bǔ)方法。Ag-HPLC常用于分離TAGs異構(gòu)體，其分離原理是根據(jù)固定相中的Ag+與TAG中雙鍵的π電子之間的電荷轉(zhuǎn)移作用分離TAGs，因此TAGs中雙鍵數(shù)目及位置決定著保留時(shí)間。Holapeka等[26]通過(guò)串聯(lián)三根Ag+液相色譜柱(ChromSpher Lipids,Varian,USA)分離TAGs雙鍵位置異構(gòu)體及脂肪酸酰基位置異構(gòu)體，分別聯(lián)用5種不同類型的質(zhì)譜檢測(cè)器，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，檢測(cè)器的類型對(duì)得到的碎片離子豐度比的影響低于脂肪酸的雙鍵數(shù)目、雙鍵位置及?；溤诟视凸羌苤械姆植嘉恢脤?duì)得到的碎片離子豐度比的影響。同時(shí)也表明串聯(lián)三根Ag+液相色譜柱仍無(wú)法分離sn-2位TAG雙鍵位置異構(gòu)體(如Lα-LnL與Lγ-LnL)[27,28]。

Ag-HPLC分離TAG時(shí)的分離效率受三個(gè)因素影響：流動(dòng)相組成、柱溫及色譜柱性能[29]。合適的流動(dòng)相能顯著提高Ag-HPLC分離TAG異構(gòu)體的分離效率，而柱溫對(duì)TAG異構(gòu)體在Ag+色譜柱中保留時(shí)間的影響相當(dāng)復(fù)雜。目前Ag-HPLC使用的色譜柱主要為商品化Spher Lipids色譜柱[30]。但常規(guī)Ag+色譜柱對(duì)多不飽和TAGs的分析都表現(xiàn)出低重現(xiàn)性，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)雙鍵數(shù)大于7的TAG異構(gòu)體的分離，對(duì)于雙鍵數(shù)更多的TAGs，出峰時(shí)間很長(zhǎng)甚至不出峰。

Leskinen等[31]通過(guò)將Ag+鍵合于EC 250/4.6 Nucleosil 100-5 SA色譜柱，成功分離黑加侖籽油中Ala/L/L與Gla/L/L(Ala為α-亞麻酸，Gla為γ-亞麻酸，L為亞油酸)雙鍵位置異構(gòu)體。Dillon等[32,33]將Ag+鍵合到3-巰基丙基固定相上制備硫醇銀(AgTCM)液相色譜柱，其分離原理與Ag+的分離原理相似，都能按照雙鍵數(shù)不同將分析物分離。由于硫醇和Ag+形成了較強(qiáng)的配位化合物，使得AgTCM色譜柱的穩(wěn)定性及分析物保留時(shí)間的重現(xiàn)性較常規(guī)Ag+色譜柱更佳，但目前只應(yīng)用于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸乙酯的分離。

Ag-HPLC雖然可以分離TAG酰基位置異構(gòu)體及雙鍵位置異構(gòu)體，但分離含EPA和DHA等LC-PUFAs TAGs位置異構(gòu)體仍然是一個(gè)難題[34]，通常需要串聯(lián)兩根或兩根以上的Ag+色譜柱，但也只能實(shí)現(xiàn)部分TAG異構(gòu)體分離，不僅耗時(shí)，而且增加了分析成本。

表1列出了文獻(xiàn)中已報(bào)道的不同液相色譜柱分離鑒定長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的研究及其應(yīng)用。

表1 不同液相色譜柱分離長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的應(yīng)用

3 LC-PUFAs TAGs的直接進(jìn)樣質(zhì)譜鑒定技術(shù)

直接進(jìn)樣MS應(yīng)用最廣泛的電離源是電噴霧電離(Electronic Spray Ion，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)。MS成像技術(shù)可以提供形象化的脂肪酸分布信息，Shah等[50]應(yīng)用此方法已形象化的鑒定了人血漿中不飽和度為3的TAG分子。由于其可視化的優(yōu)點(diǎn)，常被用于生物樣品分析，主要用于多種生物樣品中LC-PUFAs磷脂分子分析。

3.1 電噴霧電離質(zhì)譜

近年來(lái)，也有很多新型技術(shù)應(yīng)用于ESI-MS中，用于鑒定LC-PUFAs TAGs。2012年，Pham等[55]首次將原子團(tuán)定向解離方法應(yīng)用于油脂分析，通過(guò)向TAG異構(gòu)體中添加4-碘苯胺(IA)形成[TAG+IA]+，在一定的CID作用下，[TAG+IA]+發(fā)生α斷裂與β-裂解，因而產(chǎn)生不同的碎片離子，根據(jù)這些碎片離子可鑒定TAG中脂肪酸位置和雙鍵位置，應(yīng)用該方法已成功鑒定了含亞麻酸的TAG?；恢卯悩?gòu)體及雙鍵位置異構(gòu)體。

3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜

近年來(lái)，MALDI-MS已越來(lái)越多用于脂質(zhì)分析。同ESI-MS一樣，這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于分析磷脂[56]、TAGs[57]以及脂肪酸[58]。MALDI與ESI-MS不同的是對(duì)所有的脂質(zhì)都能產(chǎn)生正離子，使得在一個(gè)圖譜中能觀察到寬范圍的脂類。MALDI的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)基質(zhì)的耐受性，如緩沖鹽等，且適合大量樣品的生物學(xué)分析?？梢酝ㄟ^(guò)添加相應(yīng)的鹽產(chǎn)生[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等離子。Kubo等[59]采用單一同位素前體離子模式分析橄欖油中的TAG，通過(guò)高能量的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)使加鈉TAG產(chǎn)生遠(yuǎn)電荷碎裂，提高了前體離子選擇性，實(shí)現(xiàn)TAG更完整的分析。Danielewicz等[60]利用MALDI技術(shù)分析了微藻油中TAGs的組成，鑒定出C數(shù)為18和20，雙鍵數(shù)最高為4的多不飽和脂肪酸，同時(shí)也指出由于MALDI常與飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)聯(lián)用，其靈敏度很高，對(duì)每個(gè)TAGs相似物都有響應(yīng)，不適合用于定量含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的TAGs。MALDI-MS需要合適的基質(zhì)才能獲得好的重現(xiàn)性及靈敏度，其定性定量能力不如ESI-MS和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)。

4 LC-PUFA TAG不同分析方法的比較

常用于分離LC-PUFA TAG的色譜方法有：TLC、HTGC、HPLC及2D-LC。TLC具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，但利用該方法分離甘油三酯時(shí)，分離回收的效果受硅膠板、擴(kuò)展劑及操作水平等因素的影響較大，且定量困難。HTGC可以直接分析TAG，TAG在耐高溫的氣相色譜柱上按C數(shù)由小到大依次洗脫，但長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸在高溫下容易發(fā)生熱降解，因此HTGC更適合用于分析相對(duì)飽和的TAG。NARP-HPLC法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)具有不同ECN值TAGs的有效分離，但是難以分離具有相同ECN值的TAG，對(duì)TAG位置異構(gòu)體的分離選擇性也較差。Ag+色譜可以根據(jù)甘油三酯的雙鍵數(shù)目、雙鍵位置等因素將ECN值相同的甘油三酯進(jìn)行分離，是非水反相液相色譜法的有效補(bǔ)充，TAG雙鍵數(shù)越多，在Ag+色譜柱上的保留時(shí)間越長(zhǎng)，串聯(lián)三根Ag+色譜柱仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)雙鍵數(shù)大于7的LC-PUFA TAG位置異構(gòu)體的分離[61]。將NARP-HPLC和Ag-HPLC兩種不同保留機(jī)理的分離模式離線或在線聯(lián)用，構(gòu)建2D-HPLC分離系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)TAG高選擇性分離的有效途徑。此外，最近有研究采用無(wú)封端聚合ODS柱(Non-endcapped Polymeric ODS，ODS-P)實(shí)現(xiàn)了對(duì)LC-PUFA TAG位置異構(gòu)體的分離。

5 LC-PUFAs TAGs的定量手段

5.1 LC-PUFAs TAGs的定量方法

胡珺等[36]研究發(fā)現(xiàn)，雙鍵數(shù)大于3和小于3的TAG在質(zhì)譜上的響應(yīng)有著很大的差別，進(jìn)而將食用油中的甘油三酯根據(jù)不飽和度不同分為兩組(不飽和度大于等于3和小于3)，通過(guò)選取各組中具有代表性的7種甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后選取與目標(biāo)TAGs結(jié)構(gòu)最為相似的標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)TAGs進(jìn)行定量分析。該類比標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法有效地克服了不同結(jié)構(gòu)甘油三酯質(zhì)譜峰響應(yīng)差別比較大的問(wèn)題，解決了需要對(duì)所有甘油三酯都建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以達(dá)到其量化的問(wèn)題。此外，還有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了使用響應(yīng)因子對(duì)甘油三酯進(jìn)行定量分析的方法。Li等[62]在定量擬南芥中TAG時(shí)，采用ESI-MS多重中性丟失掃描模式，以相同C數(shù)，不同雙鍵數(shù)的TAGs以及不同C數(shù)，相同雙鍵數(shù)的TAGs在質(zhì)譜上的相對(duì)響應(yīng)因子(設(shè)十七碳烯酸三甘油酯的響應(yīng)因子為1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，共定量了擬南芥種子中93個(gè)TAGs分子。

5.2 LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體的定量方法

目前主要有三種方法用于定量分析TAG異構(gòu)體。最早用于定量分析TAGs異構(gòu)體的方法是利用酶的選擇性水解作用。雖然酶對(duì)立體定向位置和特定碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸的選擇性是已知的，但是準(zhǔn)確地應(yīng)用酶的立體選擇性依賴于實(shí)驗(yàn)條件，通常不能實(shí)現(xiàn)直接定量。第二種方法是色譜分離TAGs異構(gòu)體，聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行鑒定，但是LC-PUFAs TAG異構(gòu)體的色譜分離仍是一大難題。第三種方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，不需要實(shí)現(xiàn)對(duì)異構(gòu)體的分離，通過(guò)建立不同濃度比的異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品與碎片離子豐度比的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行定量。Herrera等[39]利用LC-ESI-MS3建立多種含EPA和DHA的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯不同含量比與碎片離子豐度比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，成功確定EPA，DHA在魚油TAG中酰基化位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際油脂樣品中特定異構(gòu)體的定量分析。Ramaley等[63]分別將每對(duì)LC-PUFAs TAGs?；恢卯悩?gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣，建立異構(gòu)體濃度百分比與碎片離子豐度比的曲線關(guān)系，即檢測(cè)到的碎片離子豐度比對(duì)應(yīng)為異構(gòu)體對(duì)中一個(gè)異構(gòu)體的濃度百分比，用該方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品中異構(gòu)體各組分的定量，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)所建立的含有EPA 、DHA 的四對(duì)甘油三酯酰基位置異構(gòu)體的曲線為非線性關(guān)系。

6 結(jié)論與展望

色譜與質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，已能實(shí)現(xiàn)對(duì)許多甘油酯的組成及結(jié)構(gòu)的高效、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的分離鑒定。但對(duì)具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，易氧化的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的分析仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，缺少高純度的LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體標(biāo)品，而合成這樣的異構(gòu)體需要花費(fèi)高額的費(fèi)用，成為限制其鑒定的主要原因；其次，LC-PUFAs TAGs不飽和度較高，碳鏈較長(zhǎng)，質(zhì)譜裂解機(jī)制復(fù)雜，分離鑒定難，進(jìn)而增加了定量難度。因此對(duì)LC-PUFAs TAGs的研究方向包括：建立LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體的合成方法，大力開發(fā)和優(yōu)化各種色譜分析手段與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，完善快速、高通量、高靈敏度的剖析LC-PUFAs TAGs的方法，并進(jìn)一步完善定量分析方法。