吸入氫氣對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

張泉三+鞏霞+王濱+等

[摘要] 目的 探討吸入氫氣對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。 方法 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：假手術(shù)組（SH組），缺血再灌注組（I/R組），1%氫氣組（1%H2組），2%氫氣組（2%H2組）。除SH組外，其他各組通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min后恢復(fù)血流并持續(xù)120 min，制作大鼠缺血再灌注損傷模型。1%H2組、2%H2組在再灌注過(guò)程中持續(xù)吸入相應(yīng)濃度的氫氣。觀察并記錄缺血前（T0）、再灌注即刻（T1）、再灌注30 min（T2）、再灌注60 min（T3）、再灌注120 min（T4）各時(shí)點(diǎn)的心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP），并在再灌注120 min時(shí)從尾靜脈抽取5 ml靜脈血，進(jìn)行血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）檢測(cè)。隨后處死大鼠取心臟，計(jì)算心肌梗死的面積，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定心肌8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的濃度。 結(jié)果 各組HR在各時(shí)點(diǎn)的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與SH組比較，I/R組、1%H2組、2%H2組的梗死面積、CK-MB、cTnI、8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6顯著升高，而MAP水平降低（P<0.05）。與I/R組比較，1%H2組、2%H2組的梗死面積、CK-MB、cTnI、8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6顯著降低，MAP水平升高（P<0.05）。1%H2組和2%H2組組間比較各觀察指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 吸入氫氣能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氫；心；缺血再灌注損傷

[中圖分類號(hào)] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）09（c）-0007-04

Impact of inhaling hydrogen on rats with myocardial ischemia reperfusion injury

ZHANG Quan-san GONG Xia WANG Bin ZHANG Cong-cong CHEN Xin-xin ZHU Jian-chang▲

Department of Emergency，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

[Abstract] Objective To explore the impact of inhaling hydrogen on rats with myocardial ischemia reperfusion injury rat. Methods 40 male rats were randomly divided into 4 groups： sham-operated group （SH group），ischemia reperfusion group （I/R group），1% hydrogen group （1%H2 group） and 2% hydrogen group （2%H2 group），each group had 10 rats.Apart from SH group，ischemia reperfusion injury rats model were made by ligation left anterior descending coronary artery for 30 min and then restored blood flow for continuing 120 min.Appropriate concentration of hydrogen were continuous inhaled in 1%H2 group and 2%H2 group.Heart rate （HR） before ischemia （T0），immediate reperfusion （T1），reperfusion for 30 min （T2），reperfusion for 60 min （T3） reperfusion for 120 min （T4） and mean arterial pressure （MAP） were observed and recorded.5 ml venous blood was extracted at 120 min after reperfusion.Creatine kinase-MB （CK-MB） and cardiac troponin I （cTnI） were tested.Then the rats were killed and hearts were removed.The area of myocardial infarction area was calculated and the levels of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine （8-OHdG），high mobility group box 1 （HMGB1），nuclear factor-kappa B （NF-κB），tumor necrosis factor α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were tested by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The HR had no significant difference at different time among 4 groups.Compared with SH group，the infarction area，lelves of CK-MB，cTnI，8-OHdG，HMGB1，NF-κB，TNF-α and IL-6 in I/R group，1%H2 group and 2%H2 group significantly increased，while the level of MAP decreased （P<0.05）.Compared with I/R group，the infarction area，levels of CK-MB，cTnI，8-OHdG，HMGB1，NF-κB，TNF-α and IL-6 in 1%H2 group and 2%H2 group significantly decreased，while the level of MAP increased （P<0.05）.The index between 1%H2 group and 2%H2 group had no significant difference （P>0.05）. Conclusion Inhaling hydrogen can alleviate myocardial ischemia reperfusion injury in rat.The mechanism may be related to inflammatory reaction and inhibit oxidative stress injury of hydrogen.

[Key words] Hydrogen；Heart；Ischemia reperfusion injury

近年來(lái)，隨著心肌梗死后溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI）不斷在臨床中普及，心肌缺血后的再灌注可能造成缺血部分心肌發(fā)生更嚴(yán)重的損傷，如心力衰竭、血壓下降，甚至心跳驟體等，嚴(yán)重影響患者的臨床預(yù)后。因此，由其引起心肌缺血再灌注損傷越來(lái)越引起人們的重視[1-2]。氫氣是一種生理惰性氣體，具有還原性。近來(lái)，有研究表明其抗原性在臨床治療缺血再灌注損傷中有特殊作用[3]。本研究探討氫氣對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響，為臨床預(yù)防缺血再灌注損傷提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

40只健康成年SD大鼠，體重（210±25）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。通過(guò)隨機(jī)數(shù)字法分為4組，每組10只，分別為：假手術(shù)組（SH組）、缺血再灌注組（I/R組）、1%氫氣組（1%H2組）和2%氫氣組（2%H2組）。

1.2 方法

大鼠稱重，通過(guò)腹腔注射20%的烏拉坦（0.5 ml/100 g）麻醉，將大鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，通過(guò)四肢皮下電極監(jiān)測(cè)心電圖的變化。分離頸部組織，暴露氣管、右頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)靜脈。右頸總動(dòng)脈置入24G導(dǎo)管，通過(guò)壓力換能器監(jiān)測(cè)心率（HR）和平均動(dòng)脈壓（MAP）。切開(kāi)氣管，連接動(dòng)物HX-300呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），潮氣量為3 ml/100 g，呼吸頻率為60～65次/min，吸呼比（I∶E）為=1∶1。在胸骨左緣2、3、4肋間手術(shù)，暴露心臟，剪開(kāi)心包。在左心耳下方尋找冠狀動(dòng)脈前降支，用6/0絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支，并在線與動(dòng)脈間放一個(gè)硅膠管并結(jié)扎，SH組只穿線不結(jié)扎。以結(jié)扎后心肌顏色變蒼白，心電圖出現(xiàn)ST段抬高為缺血的標(biāo)準(zhǔn)，以松開(kāi)結(jié)扎線心肌變紅潤(rùn)，心電圖ST段下降為再灌注的標(biāo)志。缺血30 min后松開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min。通過(guò)PGH-300氫氣發(fā)生器（北京譜萊析科技有限公司）電解水產(chǎn)生氫氣，純度為99.999%。用吸氧管將產(chǎn)生的氫氣連接到呼吸機(jī)的管道上。在近氣管處的管道上用GT901-氫氣泵吸式氫氣檢測(cè)儀（東莞市永琪電子設(shè)備有限公司）監(jiān)測(cè)并調(diào)定吸入管道氫氣的濃度。1%H2組和2%H2組在再灌注過(guò)程中吸入相應(yīng)濃度的氫氣。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血流動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測(cè) 觀察并記錄在心肌缺血前（T0）、再灌注即刻（T1）、再灌注30 min（T2）、再灌注60 min（T3）、再灌注120 min（T4）各時(shí)點(diǎn)的心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP）。

1.3.2 心肌酶標(biāo)志物的監(jiān)測(cè) 在再灌注120 min從右頸總動(dòng)脈抽取靜脈血3 ml，3500 r/min離心后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。試劑均來(lái)源于美國(guó)R&D公司。

1.3.3 大鼠心肌梗死面積的測(cè)定 再灌注結(jié)束取血液樣本后處死大鼠，取出心臟。隨機(jī)選取5只大鼠的心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖凈心腔血液干凈，用濾紙吸干，剪去心房、左室游離壁及脂肪組織，稱重。把左心室心肌橫切成5～6片，浸入含有氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）的磷酸緩沖液中，然后放入37℃水浴中，等待完全染色后取出，用濾紙吸干。缺血組織不染色，正常組織染色。缺血心肌剪下稱重，以缺血心肌與左心室濕重的百分比表示梗死面積（MIS）。

1.3.4 大鼠心肌組織中生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè) 剩余5只大鼠心臟在結(jié)扎點(diǎn)下剪下缺血區(qū)心肌組織，加入預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，在4000 r/min離心后取上清液。采用ELISA法測(cè)定心肌8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、高遷移率蛋白1（HMGB1）、核因子-кB（NF-κB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。試劑均來(lái)源于美國(guó)R&D公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較

HR在各組各時(shí)點(diǎn)的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；除SH組外，各組與 T0 比較，MAP都顯著下降（P<0.05）；與SH組比較，各組的MAP均顯著降低（P<0.05）；與I/R組比較，1%H2組和2%H2組的MAP均顯著升高（P<0.05）；1%H2組和2%H2組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較（x±s，n=10）

與同時(shí)點(diǎn)SH組比較，#P<0.05；與同組T0比較，★P<0.05

2.2 各組血清CK-MB、cTnI及MIS的比較

與SH組比較，I/R組、1%H2組、2%H2組的CK-MB、cTnI和MIS均顯著升高（P<0.05）；與I/R組比較，1%H2組和2%H2組的CK-MB、cTnI和MIS均顯著降低（P<0.05）；1%H2組和2%H2組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 各組血清CK-MB、cTnI和MIS的變化（x±s，n=10）

與SH組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

2.3 各組心肌組織中生化指標(biāo)的比較

與SH組比較，8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6均顯著升高（P<0.05）；與I/R組比較，1%H2組和2%H2組的8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6顯著降低（P<0.05）；1%H2組和2%H2組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

表3 各組心肌組織中生化指標(biāo)的比較（x±s，n=10）

與SH組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

3 討論

本研究參考文獻(xiàn)方法[4]，采取結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min后再灌注120 min來(lái)制備大鼠心肌缺血再灌注損傷的模型，根據(jù)心電圖ST段的變化確定模型制作成功。

氫氣是一種較氧氣分子更小呈電中性的分子，它具有更好的膜通透性，可以更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，能清除羥自由基、超氧陰離子，預(yù)防器官的缺血再灌注損傷[5～6]。由于氫氣的半衰期短，所以只能在持續(xù)吸入氫氣時(shí)才能發(fā)揮其抗氧化作用[7-8]。本研究在再灌注全程中持續(xù)吸入1%H2、2%H2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后，心功能出現(xiàn)異常，而1%H2組和2%H2組能改善心功能的異常情況。和I/R組比較，心肌酶（CK-MB、cTnI）和MIS均顯著降低（P<0.05），表明氫氣能減輕心肌損傷的程度，而不同濃度氫氣組間比較無(wú)明顯差異，表明吸入氫氣可能會(huì)減輕心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激是其最主要的發(fā)生機(jī)制之一[9]。當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，在早期產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），過(guò)多的ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化及DNA的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[10]。8-OHdG是DNA氧化應(yīng)激損傷最重要的標(biāo)志物，是評(píng)價(jià)機(jī)體DNA氧化應(yīng)激和機(jī)體氧化損傷的敏感指標(biāo)[11～12]。本研究中，和SH組比較，各組8-OHdG均有不同程度的升高（P<0.05），表明在心肌再灌注損傷中DNA氧化應(yīng)激發(fā)揮了重要作用。與I/R組比較，各氫氣組8-OHdG均降低（P<0.05），提示吸入氫氣可能通過(guò)減輕DNA氧化應(yīng)激和機(jī)體氧化損傷來(lái)減輕心肌的缺血再損傷。

既往研究表明，炎癥是心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[13]。HMGB1是存在于細(xì)胞的一種核蛋白質(zhì)，它在機(jī)體炎性反應(yīng)時(shí)發(fā)揮重要作用[14]。HMGB1作為T(mén)oll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的內(nèi)源性配體，它激活TLR4信號(hào)通路，通過(guò)多種途徑最終激活NF-κB，引起炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6的釋放[15]。TNF-α、IL-6是機(jī)體十分重要的炎癥因子，在炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16～17]。HMGB1在缺血再灌注損傷中起重要作用[18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，吸入氫氣組，HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6較I/R組明顯下降（P<0.05），表明它可能在再灌注損傷中發(fā)揮一定作用，吸入氫氣可能通過(guò)抑制心肌組織的炎性反應(yīng)來(lái)減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，吸入氫氣能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能和抑制氧化應(yīng)激損傷與炎性反應(yīng)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bainey KR，Armstrong PW.Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction[J].J Am Heart，2014，167（5）：637-645.

[2] Van Domburg RT，Sonnenschein K，Nieuwlaat R，et al.Sustained benefit 20 years after reperfusion therapy in acute myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2005，46（1）：15-20.

[3] Ohsawa I，Ishikawa M，Takahaski K，et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med，2007，13（6）：688-693.

[4] 劉未，羅悅晨，單娜娜，等.急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型制備的改進(jìn)及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2012，21（2）：77-78.

[5] He K，Yan L，Pan CS，et al.ROCK-dependent Atp5d mod-ulation contributes to the protection of notoginsenoside NR1 against ischemia-reperfusion-induced myocardial injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，307（12）：1764-1776.

[6] Nakashima-Kamimura N，Mori T.Molecular hydrogen alleviates nephrotoxicity induced by anti-cancer drag cisplatin without compromising anti-tumor activity in mice[J].Cancer Chemother Pharmacol，2009，64（4）：753-781.

[7] 李會(huì)，孫明潔，曹璽，等.吸入氫氣對(duì)小鼠肺缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2014，34（8）：989-991.

[8] 陳燁，黃國(guó)慶，周述芝，等.吸入氫氣對(duì)腸缺血再灌注大鼠腦氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響[J].中華器官移植雜志，2014，35（4）：237-242.

[9] Zhao W，F(xiàn)an GC.Protection of peroxiredoxin Ⅱ on oxidative stress induced cardiomyocyte death and apoptosis[J].Basic Res Cardiol，2009，104（4）：377-389.

[10] 田軼魁，董福強(qiáng)，張?chǎng)?，?活性氧簇在心肌缺血后處理抗細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（8）：1212-1214.

[11] Wu L，Lehiou CC，Chang PY，et al.Urinary 8-OHdG：a marker of oxidafives tress to DNA and a risk factor for cancer[J].Clin Claim Aeta，2004，339（7）：1-9.

[12] Xu X，Cao Z，Cao B，et al.Carbamylated erythropoietin protects the myocardium from acute ischemia/reperfusion injury through a PI3K/Akt-dependent mechanism[J].Surgery，2009，146（3）：506-514.

[13] Kinaci MK，Erkasap N，Kucuk A，et al.Effects of quercetin on apoptosis，NF-κB and NOS gene expression in renal ischemia/reperfusion injury[J].Exp Ther Med，2012，3（2）：249-254.

[14] Andersson U，Antoine DJ，Tracey KJ.The functions of HMGB1 depend on molecular localization and post-translational modifications[J].J Intern Med，2014，276（5）：420-424.

[15] Abe A，Kuwata T，Yamauchi C，et al.High Mobility Group Box1 （HMGB1） released from cancer cells induces the expression of pro-inflammatory cytokines in peritoneal fibroblasts[J].Pathol Int，2014，64（6）：267-275.

[16] Chen JW，Chen YH，Lin SJ.Long-term exposure to oxidized low-density lipoprotein enhances tumor necrosis factor-alpha-stimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-sensitive pathways[J].Free Radic Biol Med，2006，40（5）：817-826.

[17] Tischendorf JJ，Yagmur E，Scholten D，et al.The interleukin-6 （IL6）-174 G/C promoter genotype is associated with the presence of septic shock and the ex vivo secretion of IL6[J].Int J Immunogenet，2007，34（6）：413-418.

[18] 王發(fā)龍，韓菲菲，陳靜瑜，等.大鼠肺移植后高遷移率族蛋白B1表達(dá)的改變[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（12）：2434.

（收稿日期：2015-05-21 本文編輯：衛(wèi) 軻）