固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體血清中7種全氟化合物

肖永華*， 梁高道， 革麗亞， 黃常剛， 王 勝， 麥 琦

(武漢市疾病預防控制中心，湖北武漢 430022)

全氟化合物(Perfluorinated Compound，PFCs)是一類氟化有機物，它具有疏水、疏油、熱穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性好、表面活性高，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)與消費領(lǐng)域。有報道稱含氟聚合物生產(chǎn)廠以及污水處理廠是全氟化合物的主要污染源[1]。研究表明，PFCs在魚肉、蝦、豬肉、雞蛋以及飲用水中均有檢出，同時PFCs具有很高的穩(wěn)定性，在環(huán)境中不易被降解，進入生物體后會隨著食物鏈不斷累積，而人類處于食物鏈的最末端，所攝入的PFCs要遠遠高于其他生物體。毒理學研究表明，PFCs在一定劑量下具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及潛在致癌性等多種毒性效應(yīng)[2]。隨著PFCs的污染越來越受到重視，因此通過檢測人體血清中PFCs的含量來評價人群PFCs的暴露具有重要的意義。

目前檢測PFCs大多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3 - 18]，其優(yōu)點是抗干擾能力強、選擇性好、靈敏度高，在檢測痕量PFCs時具有顯著的優(yōu)勢。在樣品處理時采用較多的有石墨化炭黑分散萃取[2]、酸水解[3]、堿水解[4]、離子對試劑提取[5]以及聚酰胺粉提取[6]等。在上述研究的基礎(chǔ)上，本實驗采用酶解法來提取血清中PFCs，提取液經(jīng)沉淀蛋白以及WAX固相萃取小柱凈化后，采用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定。該方法能有效地去除基質(zhì)干擾，穩(wěn)定性好，準確度高，可作為評價人群PFCs暴露的重要技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-TQD超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Waters公司)，配備電噴霧離子源(ESI)及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；AL204電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；固相萃取裝置(美國,Agilent公司)；氮氣吹干儀(美國,Organomation Associates公司)；渦旋儀(德國,IKA公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；低速臺式離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

標準品：全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA)，均購自Sigma-Aldrich公司；內(nèi)標：13C4全氟辛酸(MPFOA)、13C4全氟辛烷磺酸(MPFOS)，均購自美國Sigma公司。β-葡萄糖醛苷酶(美國Sigma公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國天地公司)；NaAc、NaOH、NH4Ac(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；HClO4(優(yōu)級純，天津市東方化工廠)；氨水(分析純，開封東大化工有限公司試劑廠)；WAX固相萃取小柱(60 mg，3 mL，美國Waters公司)。實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液配制

標準、內(nèi)標儲備液(100 mg/L)：分別準確稱取0.0100 g全氟化合物標準品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度；內(nèi)標用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃冷凍保存。標準、內(nèi)標中間液(1 mg/L)：分別準確吸取1.00 mL儲備溶液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，4 ℃保存。內(nèi)標工作液(50 μg/L)：準確吸取5.00 mL內(nèi)標工作液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，4 ℃保存。標準工作液：臨用時將標準中間液稀釋至合適濃度標準系列，標準系列中內(nèi)標濃度均為5 μg/L。

1.3 樣品處理

稱取1.00 g血清樣品于15 mL離心管中，加入5.0 mL 0.2 mol/L的NaAc緩沖溶液以及100 μL內(nèi)標工作液，充分混勻，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，混勻后，于溫度37 ℃酶解提取12 h。在提取液中加入200 μL HClO4，充分渦旋后離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。

將WAX固相萃取小柱分別用3 mL甲醇和3 mL水活化后，取提取液過柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，最后用5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇溶解，以0.22 μm濾膜過濾后，用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS C18柱(100×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A：乙腈，B：5 mmol/L NH4Ac緩沖溶液。梯度洗脫程序：0～3.0 min,30%～70%A;3.0～6.0 min,70%A;6.0～6.1 min，70%～30%A;流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧(ESI)，負離子模式；毛細管電壓：-2.3 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。采用質(zhì)譜直接進樣的方式優(yōu)化各全氟化合物的采集參數(shù)，7種全氟化合物及2種內(nèi)標的MRM參數(shù)見表1。

表1 7種全氟化合物及2種內(nèi)標的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters of 7 PFCs and 2 internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

圖1 7種全氟化合物及2種內(nèi)標的總離子流色譜圖(TIC)Fig.1 TIC of 7 PFCs and 2 internal standards 1,2：PFHxS，PFHpA；3,4：MPFOA，PFOA；5,6,7.PFOS，MPFOS，PFNA；8：PFDA；9：PFUnDA.

實驗比較了甲醇-NH4Ac緩沖溶液和乙腈-NH4Ac緩沖溶液兩種體系的分離效果、靈敏度以及背景干擾。結(jié)果表明，在這兩種體系中，PFCs各組分峰形良好，靈敏度沒有明顯差異。但在甲醇-NH4Ac緩沖體系中，PFNA、PFOA以及PFHxS存在背景干擾現(xiàn)象，而乙腈-NH4Ac緩沖體系中沒有明顯的背景干擾，因而本實驗選擇乙腈-NH4Ac緩沖溶液體系作為流動相。PFCs各組分的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

文獻報道樣品處理時采用較多的有酸水解、堿水解、離子對試劑提取以及石墨化炭黑分散萃取等。由于PFCs與蛋白結(jié)合在一起，常規(guī)的乙腈沉淀蛋白不能有效地提取血清中的PFCs，在回收率實驗中，血清樣品加入7種全氟化合物及2種內(nèi)標后，通過乙腈沉淀蛋白，離心后取上清液直接測定時7種全氟化合物及2種內(nèi)標的響應(yīng)值均明顯降低，回收率均小于50%。因而本實驗首先利用酶解的方法使與蛋白相結(jié)合的PFCs 釋放出來，再加入HClO4沉淀蛋白質(zhì)，離心后上清液用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，將溶液過WAX固相萃取小柱，用3.0 mL 50%甲醇水溶液淋洗小柱，最后用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液作為洗脫液洗脫小柱所吸附的PFCs(本實驗曾分別用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫兩次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有PFCs組分均在第一次被完全洗脫下來)，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇復溶。

2.3 線性范圍、回收率、精密度及檢出限

全氟羧酸類化合物PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA以MPFOA為內(nèi)標，全氟磺酸類化合物PFHxS、PFOS以MPFOS為內(nèi)標，7種全氟化合物在1.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上；在血清樣品中添加濃度為25 μg/kg的7種全氟化合物標準，內(nèi)標MPFOS和MPFOA的添加濃度均為5 μg/kg，分別做6個加標平行樣和2個血清本底，7種全氟化合物的平均回收率為74.0%～105.6%，結(jié)果見表2。通過逐級稀釋法來確立本方法的檢出限，當7種PFCs進樣濃度為0.05 μg/L時，7種PFCs的信噪比均大于3，經(jīng)回收率校正后，選擇0.1 μg/kg作為本方法7種PFCs的檢出限。

表2 7種PFCs的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及回收率(n=6)Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and recoveries of 7 PFCs(n=6)

2.4 實際樣品的測定

隨機選擇24位本單位健康體檢人群的血清樣品測定PFCs，結(jié)果表明：PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA均有檢出。PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA檢出率均為100%，其中PFOA和PFOS的含量要遠高于其他4種PFCs。血清中PFHpA均未檢出，檢出情況詳見表3。血清樣品中PFOA和PFOS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖2。

圖2 人體血清樣品中PFOA和PFOS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of PFOA and PFOS in human serum samples

表3 人體血清樣品中7種PFCs的測定結(jié)果Table 4 Determination results of 7 PFCs in human serum samples

3 結(jié)論

隨著食物鏈的富集，人體中的PFCs含量要遠高于環(huán)境以及食品中PFCs的含量，如何通過保護以及改善環(huán)境來控制和降低人群PFCs的攝入量，需要引起更多人的重視。本文通過對樣品前處理、色譜以及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體血清中7種PFCs的分析方法。該方法靈敏度高，準確度好，可作為人群PFCs暴露監(jiān)測的技術(shù)支撐。