NADPH氧化酶在常見心血管疾病中的表達與作用

王夢龍 萬 軍

武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060

越來越多的證據(jù)顯示，活性氧（reactive oxygen species，ROS） 生成增多引起的氧化應激參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1]，而臨床抗氧化應激試驗（補充抗氧化劑維生素）的失敗說明氧化應激與心血管疾病之間可能存在更為復雜的關系[2-3]。 正常情況下ROS通過激活不同的信號途徑維持細胞的生理功能，如細胞增殖、分化和遷移等；而病理情況下，高水平的ROS導致細胞功能的紊亂和疾病的發(fā)生?，F(xiàn)有的研究提示ROS 的作用高度依賴于ROS 的來源、存在的部位、局部濃度，甚至與ROS 種類相關[4]。心臟和血管組織ROS有以下幾種來源：線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶、解偶聯(lián)的內(nèi)皮一氧化氮合酶和NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，Nox）[5]。Nox 是一類以生成ROS 為主要功能的蛋白質，明確Nox 在常見心血管疾病中的表達及其作用對臨床抗氧化治療的實施具有重要意義。

1 NADPH 氧化酶家族概述

Nox2 是最早發(fā)現(xiàn)的Nox 亞型，能夠將NADPH 的電子傳遞給分子氧，生成超氧陰離子（O2-）[6]。 Nox2 表達于細胞膜，由胞膜亞基Nox2（gp91phox）、p22phox和胞漿亞基p40phox、p47phox、p67phox、Rac1 組成， 生理狀態(tài)下不具有活性，其活化需要胞漿亞基相互結合并轉位到細胞膜。 與Nox2 不同，Nox4 主要表達于核膜周圍，包括細胞核、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等，處于持續(xù)激活狀態(tài)，不具有胞漿亞基， 其活性的調(diào)節(jié)主要依賴Nox4 mRNA或蛋白水平的變化， 且Nox4 激活后主要產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），而非O2-[6]。目前共發(fā)現(xiàn)7 種Nox 亞型：Nox1～5 和雙氧合酶1、2， 心血管系統(tǒng)中主要表達Nox1、Nox2、Nox4 和Nox5，這些亞型在心肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞中均有表達，其中心肌細胞主要表達Nox2 和Nox4[7]。

2 NADPH 氧化酶在常見心血管疾病中的作用

2.1 心肌肥厚與心力衰竭

研究證實Nox 活性增高是心衰患者心肌ROS 生成增多的主要原因[8-10]。進一步分析發(fā)現(xiàn)心衰時Nox4、Nox2 及Nox2 亞基mRNA 水平無明顯變化，其活性的增加可能與Nox2 亞基p47phox由胞漿向胞膜轉移增加引起[9-10]。 同時，研究還發(fā)現(xiàn)Nox 活性的增加與引起心衰的病因無關，在擴張型心肌病和缺血性心肌病患者心肌中，Nox 活性相似[11]。

心肌肥厚是心力衰竭過程中重要的病理生理改變。研究發(fā)現(xiàn)，Nox2 活性在血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ） 引起的小鼠心肌肥厚模型中增高， 敲除Nox2 可以降低AngⅡ誘導的左室肥厚程度，同時心肌肥厚標志物如ANP、β-MHC 等水平下降[12]。 敲除Nox2的活性調(diào)節(jié)分子Rac1 得到類似的結果[13]，提示Nox2在AngⅡ誘導的心肌肥厚中起重要作用。 Nox2 發(fā)揮作用的機制可能與ERK1/2、AKT、ASK1/NF-κB 活性的改變有關[13-15]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)在主動脈縮窄術誘導的心肌肥厚模型中， 敲除Nox2 的小鼠和野生型小鼠出現(xiàn)同等程度的心肌肥厚[16]，提示Nox的功能可能具有亞型特異性，Nox2 僅在AngⅡ誘導的心肌肥厚中起作用，而并不參與壓力負荷誘導的心肌肥厚。 在Nox2 敲除小鼠中，壓力負荷可引起Nox4水平代償性的增高[16]，這可能是Nox2 在壓力負荷模型中不起作用的原因之一。

Nox4 在壓力負荷心肌肥厚模型中起何種作用，結論尚不統(tǒng)一。 有學者發(fā)現(xiàn)Nox4 敲除小鼠在壓力負荷模型中出現(xiàn)更嚴重的左室肥厚和左室收縮功能障礙，伴有心室的擴張，而過表達Nox4 出現(xiàn)相反的心臟表型，說明Nox4 在心肌肥厚時起保護作用[17]。 缺氧誘導因子Hif1α 的上調(diào)可能參與了Nox4 對壓力負荷模型的保護作用， 但Nox4 通過何種途徑上調(diào)Hif1α 尚需進一步研究[17]。 而Sadoshima 實驗室的研究卻得出相反的結論， 即Nox4 在壓力負荷誘導的心肌肥厚模型中起損害作用[8]。 兩個研究得出不同結論的原因尚不清楚，推測與小鼠遺傳背景、基因敲除或過表達技術的不同以及心肌肥厚嚴重程度相關。

2.2 冠狀動脈粥樣硬化和心肌梗死

ROS 可以將低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化成ox-LDL 并在內(nèi)皮下沉積，促進粥樣斑塊的形成。 同時ROS 還可促進平滑肌細胞遷移、增殖和凋亡，進而引起冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙[18]。 在人心臟冠脈血管， 非粥樣斑塊區(qū)域血管內(nèi)膜、 中膜和外膜ROS 生成量基本一致，而在粥樣斑塊區(qū)域，因巨噬細胞聚集，ROS 生成明顯增多。 進一步分析發(fā)現(xiàn)Nox2及其亞基p22phox主要定位于巨噬細胞， 而Nox4 主要在非巨噬細胞， 且Nox2、p22phoxmRNA 含量與粥樣斑塊嚴重程度相關[19]。 動物實驗證實Nox 活性增加促進高脂飲食引起的動脈粥樣硬化，運動訓練或轉變?yōu)檎ｏ嬍晨梢越档蚇ox 活性和ERK1/2、JNK 磷酸化水平，從而逆轉動脈粥樣硬化相關危險因素[20]。 不穩(wěn)定斑塊與急性冠脈綜合征的發(fā)生密切相關，氧化應激水平的增加促進斑塊成分的改變和斑塊的進展，導致斑塊不穩(wěn)定。 近期研究發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)Nox4 水平的增加可促進斑塊內(nèi)平滑肌細胞的表型轉變，引起斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂，從而導致心肌梗死的發(fā)生[21]。

通過免疫組化和Western Blot 技術，研究者發(fā)現(xiàn)急性心梗后， 梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)心肌細胞Nox2 表達明顯增加， 而遠離心梗部位心肌細胞Nox2 含量并無明顯變化，提示Nox2 生成的ROS 可能參與心梗的發(fā)生[22]。動物實驗也證實在心肌梗死后心肌細胞Nox2和Nox4 表達增高[23-24]，抑制Nox2 或Nox4 不減少心肌梗死面積，但可以減輕心室擴張程度，同時改善收縮功能，大幅提高小鼠存活率[24-27]，說明Nox 是干預心肌梗死后心肌重構的重要靶點。 但目前對于Nox2 和Nox4 在心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷時的亞型特異性作用了解甚少。 全身性敲除Nox2與Nox4 小鼠在I/R 損傷時出現(xiàn)相似的表型：I/R 損傷后，心肌ROS 水平和梗死面積基本一致[28]，提示定位于細胞不同部位的Nox2 和Nox4 產(chǎn)生的ROS 在I/R損傷時的作用相似。 盡管Nox2 生成的主要是O2-，但在超氧歧化酶作用下，O2-很快歧化生成H2O2，而H2O2具有很高的膜通透性，這可能是Nox2 與Nox4 在I/R損傷時作用相似的原因。 另外，心臟特異性敲除Nox4小鼠在I/R 刺激時出現(xiàn)與全身性Nox4 敲除小鼠同等程度的心肌損傷，說明心肌細胞中的Nox4，而非其他細胞來源（如巨噬細胞）的Nox4，參與了I/R 損傷時心肌細胞功能的改變[28]。一定水平的ROS 對心肌細胞正常生理功能的維持和心肌損傷時的適應性反應是必需的。心肌特異性過表達負向調(diào)控Nox 小鼠可以抑制所有Nox 亞型， 該小鼠與雙敲除Nox2 和Nox4 的小鼠在受到I/R 損傷時， 盡管ROS 水平比單獨敲除Nox2 或Nox4 小鼠更低，心肌梗死面積反而更大[28]。

2.3 心律失常

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床上常見的一種心律失常，心房結構重構與電重構在AF 的誘發(fā)和維持中起重要作用?，F(xiàn)有證據(jù)表明心房氧化應激途徑在AF 病理生理過程中起重要作用[29-30]。 AF 患者心耳組織Nox 活性增加，ROS 生成增多， 通過調(diào)節(jié)肺靜脈和心房細胞的電活動， 引起異位起搏點活性增加，導致AF 發(fā)生[31]。 Nox 活性在陣發(fā)性房顫和永久性房顫患者心耳組織中并無明顯不同，Real-time PCR 結果也證實Nox2 mRNA 水平在兩種患者心耳組織中表達量相似[32]。 但目前尚無統(tǒng)一結論說明何種Nox 亞型在AF 患者Nox 活性調(diào)節(jié)中起主要作用。 Zhang 等[31]的研究提示AF 患者左心耳Nox4 mRNA 水平增加，與心耳組織H2O2水平正相關。 而Kim 等[33]并未在AF患者右心耳組織中檢測到Nox4 的表達。 在對Nox 參與AF 的機制探討中， 研究者發(fā)現(xiàn)Nox2 可以激活蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ,CaMKⅡ)， 活化的PKA 可以導致鈉電流和鈣電流的紊亂；同時活化的CaMKⅡ增加肌漿網(wǎng)Ca2+外漏，通過這兩種不同的途徑參與了AngⅡ誘導心肌細胞早期后除極[34-35]。

2.4 高血壓病

研究發(fā)現(xiàn)Nox 同樣是血管系統(tǒng)ROS 的主要來源。 病理因素刺激時，Nox 被激活，產(chǎn)生大量的ROS，導致血管內(nèi)皮功能的紊亂和疾病的發(fā)生。 Nox 生成的O2-很快歧化生成具有高度膜通透性的H2O2， 而H2O2是重要的血管舒張因子， 因此過表達Nox4 可以增加內(nèi)皮依賴性血管舒張作用[36]。 此外，H2O2還可以增加內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達與活性，從而促進血管舒張因子一氧化氮的合成[37]。

高血壓病是一種復雜的、具有多種調(diào)控因素的疾病，高血壓病患者血管Nox 表達水平尚不清楚，動物實驗發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠主動脈Nox4 表達下降[38]。另有學者發(fā)現(xiàn)，與血壓正常大鼠相比，自發(fā)性高血壓大鼠基底動脈Nox4 mRNA 水平升高4.1 倍[39]，這些結果提示Nox 在高血壓病血管中的表達可能與血管部位相關。 Nox 在高血壓病中的作用在AngⅡ誘導的高血壓模型中得到充分證實。Nox1 或Nox2 缺失小鼠在AngⅡ刺激時不會出現(xiàn)血壓升高[40-41]，而平滑肌特異性過表達Nox1 或內(nèi)皮特異性過表達Nox2 小鼠在AngⅡ刺激時血壓升高更為顯著[42-44]。然而，內(nèi)皮特異性過表達Nox4 卻可以導致小鼠基礎血壓的下降， 可能與過表達Nox4 導致H2O2含量大幅升高、內(nèi)皮依賴性血管舒張作用增強有關[36]。 不同Nox 在高血壓病中作用不同可能與其生成的ROS 類型不同有關[45]，Nox1 或Nox2 主要生成O2-，而Nox4 主要生產(chǎn)H2O2。 另外，有證據(jù)表明大腦的Nox 參與了AngⅡ誘導的血壓反應。下調(diào)大腦Nox 水平可以降低全身性或大腦局部AngⅡ處理引起的血壓升高[46-47]。 盡管關于Nox 在高血壓病中作用的研究大部分是在AngⅡ模型中完成，有少量研究表明Nox 參與了腎性高血壓的形成。在Nox 缺失的小鼠中，醋酸脫氧皮質酮高鹽不能誘導小鼠出現(xiàn)高血壓模型[48-49]。進一步分析其原因發(fā)現(xiàn)，腎小球致密斑表達Nox 蛋白，可能參與了球-管反饋，進而參與高血壓的形成。

3 小結與展望

利用NADPH 的電子生成ROS 是Nox 的唯一作用，而Nox 復雜的激活和活性調(diào)節(jié)過程以及下游不同的信號途徑提供了多種干預病理生理過程的靶點。通過探討Nox 在常見心血管疾病中的表達與作用可以發(fā)現(xiàn)，Nox 在病理生理過程中的作用很大程度上取決于活化的Nox 亞型及其表達水平。目前對于Nox 的亞型特異性作用研究尚不充分，同時尚未開發(fā)出針對不同Nox 亞型的特異性抑制劑[50]。ROS 在病理生理過程中的“雙刃劍”作用增加了臨床抗氧化治療的難度，因此需要更多的研究明確不同Nox 亞型的作用，并開發(fā)出Nox 亞型特異性抑制劑，從而更好地開展臨床抗氧化治療。

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