鱸魚骨酸溶性和酶溶性膠原的性質(zhì)比較

馬國(guó)紅　張延華　宋理平

摘要：以鱸魚骨為原料提取得到酸溶性膠原（ASC）和酶溶性膠原（PSC），對(duì)ASC和PSC的性質(zhì)進(jìn)行比較。粘度測(cè)定結(jié)果表明，ASC的變性溫度25～30 ℃，PSC的變性溫度為30～35 ℃；電泳結(jié)果表明，ASC和PSC都屬于Ⅰ型膠原且純度比較高；氨基酸分析結(jié)果顯示，羥脯氨酸和脯氨酸含量ASC均低于PSC，氨基酸檢測(cè)結(jié)果與粘度檢測(cè)結(jié)果相一致。

關(guān)鍵詞：酸溶性膠原（ASC）；酶溶性膠原（PSC）；電泳；粘度；氨基酸

膠原蛋白（或膠原）是由三條多肽鏈組成的呈螺旋結(jié)構(gòu)的高分子蛋白質(zhì)，具有一定的生物活性，廣泛存在于生物體的結(jié)締組織中，具有支撐和保護(hù)生物體的功能[1-2]。因膠原蛋白其良好的生物相容性、加工適應(yīng)性和低免疫排斥性，近年來在醫(yī)學(xué)材藥、組織工程、美容、食品保健等領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用。

利用魚皮、魚鱗、魚骨提取膠原的研究越來越被人們所重視，本研究以鱸魚骨為原料提取得到酸溶性膠原（ASC）和酶溶性膠原（PSC），并對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)試、比較，從而為今后水產(chǎn)品的深加工提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)用鱸魚購自濟(jì)南市海鮮市場(chǎng)，為冰鮮鱸魚，宰殺后取魚骨放入聚乙烯密封袋中，置于-25 ℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)儀器包括：NDJ-1B旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；CS-501超級(jí)恒溫水浴，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DL-5-B型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；JB300-D型強(qiáng)力攪拌器，上海標(biāo)本模型廠；EPS-300電泳儀，北京六一儀器廠；ND-1勃氏粘度測(cè)試儀，上?；瘜W(xué)試劑公司；日立835氨基酸分析儀，日本Hitachi公司。

1.2 鱸魚骨膠原提取方法

樣品前處理：冰凍原料→去雜蛋白（0.1 mol/L NaOH浸泡6 h）→脫鈣（0.5 mol/L EDTA浸泡5 d，每24 h換一次溶液）→脫脂（10%異丙醇浸泡24 h）→冷凍干燥→冰箱保存。

ASC的提取：冷凍干燥材料→0.5 mol/L乙酸提取72 h（每24 h更換溶液一次）→離心取上清→0.9 mol/L NaCl鹽析三次→透析（0.5 mol/L乙酸24 h→0.1 mol/L乙酸24 h→蒸餾水24 h，中間多更換幾次溶液）→冷凍干燥→冷凍保存。

PSC的提?。豪鋬龈稍锊牧稀?.5 mol/L乙酸+2‰胃蛋白酶（1∶3 000）提取72 h→離心取上清→0.9 mol/L NaCl鹽析三次→透析（0.5 mol/L乙酸24 h→0.1 mol/L乙酸24 h→蒸餾水24 h，中間多更換幾次溶液）→冷凍干燥→冷凍保存。

所有操作均在4 ℃以下進(jìn)行。

1.3 檢測(cè)內(nèi)容及方法

1.3.1 膠原粘度的測(cè)定 取300 mg膠原溶于4 ℃的40 mL 0.1 mol/L的乙酸溶液，用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)在不同溫度下測(cè)定粘度值，測(cè)定溫度15～45 ℃（間隔5 ℃），每個(gè)溫度點(diǎn)保持30 min，以粘度值降低50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度為變性溫度。

1.3.2 SDS-PAGE電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳） 取2 mg膠原溶于4 ℃的1 mL 0.1 mol/L乙酸溶液，該溶液100 μL與100 μL SDS樣品處理液混合后，沸水浴加熱5 min，電泳上樣10 μL，濃縮膠80 v，分離膠120 v，電泳4 h左右。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色15 min，脫色直至無底色，做成干膠，掃描保存。

1.3.3 膠原氨基酸檢測(cè) 氨基酸測(cè)定采用鹽酸水解前處理法，即將樣品用6 mol/L的HCl在110 ℃水解20 h后用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

膠原蛋白是由3條左手螺旋構(gòu)型的多肽鏈（即α鏈）組成的三股螺旋結(jié)構(gòu)， α鏈又互相纏成右手螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)成超螺旋結(jié)構(gòu)[3]。由圖1可以看出，鱸魚骨ASC、PSC電泳圖譜較為相似，都有4條比較清晰的條帶，分別為α1、α2、β和γ。α鏈至少由α1和α2組成，β鏈含量較高，并含有少量的γ鏈，這是典型的Ⅰ型膠原蛋白的特征，γ條帶是兩條α肽鏈的聚合體，分子量在260 kDa左右，是α肽鏈的兩倍，；α1鏈分子量高于α2鏈，分子量在130 kDa左右。電泳結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)制備的膠原分子完整，分子量大于300 kDa，圖譜上無其它蛋白質(zhì)雜帶，所提取膠原為Ⅰ型膠原且純度比較高。同時(shí)，根據(jù)在電泳中膠原分子遷移位置的差別，可以看出鱸魚骨PSC分子量小于鱸魚骨ASC的分子量。這可能是因?yàn)槲傅鞍酌阜翘禺愋缘那袛嗔四z原蛋白的部分尾肽，從而使得PSC的分子量略微減小所致[4]。這與金成[5]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 粘度（變性溫度）的測(cè)定

由受熱引起的膠原變性與膠原溶液的粘度變化有關(guān)[6]。膠原變性的結(jié)果是蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象發(fā)生改變，肽鏈由規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)卷曲狀態(tài)[5]。由圖2可以看出，鱸魚魚骨ASC的變性溫度為25～30 ℃，PSC的變性溫度為30～35 ℃，PSC>ASC，同時(shí)，PSC的變性起始溫度也高于ASC。曾名勇等[7]測(cè)定了鳙、鱸、鯽魚魚皮ASC的熱變性溫度分別為30、25、27 ℃，而鳙魚、鱸魚、鯽魚的棲息水溫分別為32 ℃，26～27 ℃，29 ℃，與其ASC的變性溫度相適應(yīng)。所以酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度與其棲息的水環(huán)境溫度相關(guān)，汪海波等也研究認(rèn)為膠原的熱變性溫度與其所處的環(huán)境溫度有關(guān)[8]。

本實(shí)驗(yàn)中鱸魚骨ASC的變性溫度與鱸魚皮的變性溫度相差不大，鱸魚骨PSC的變性溫度稍高于ASC。 許多研究[7，9-10]證明：膠原中亞氨酸（羥脯氨酸和脯氨酸統(tǒng)稱為亞氨酸）含量越高，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，膠原蛋白的變性溫度也越高。Johnston-Banks[11]研究認(rèn)為亞氨基酸的砒咯環(huán)和羥脯氨酸的羥基形成的氫鍵對(duì)膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。實(shí)驗(yàn)測(cè)得鱸魚骨ASC羥脯氨酸含量為9.41g/100 g，PSC羥脯氨酸含量為9.53 g/100 g；ASC脯氨酸含量為14.33 g/100 g，PSC脯氨酸含量為14.52 g/100g （表1），PSC亞氨酸含量高于ASC， 氨基酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果與熱變性結(jié)果相吻合。

鱸魚骨ASC、PSC共檢測(cè)出15種氨基酸，其中包括6種必需氨基酸（賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸）和8種非必需氨基酸（脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸），由表1可以看出，鱸魚骨ASC、PSC具有非常相似的氨基酸組成，其中甘氨酸含量最高，丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和羥脯氨酸含量相對(duì)較高，酪氨酸、蛋氨酸和胱氨酸含量未檢出。符合膠原蛋白的基本特性。

3 小結(jié)

粘度測(cè)定結(jié)果表明，ASC的變性溫度25～30 ℃，PSC的變性溫度為30～35 ℃；電泳結(jié)果表明，ASC和PSC都屬于Ⅰ型膠原且純度比較高；氨基酸分析結(jié)果ASC羥脯氨酸含量為9.41 g/100 g，PSC羥脯氨酸含量為9.53 g/100 g，ASC脯氨酸含量為14.33 g/100 g，PSC脯氨酸含量為14.529.53 g/100 g，氨基酸檢測(cè)結(jié)果與粘度檢測(cè)結(jié)果相一致。

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Abstract：Acid-soluble and pepsin-soluble collagens （ASC and PSC） were extracted from the bond of Lateolabrax japonicus C and partially characterized.The compositions and certain properties of Acid-soluble and pepsin-soluble collagens （ASC and PSC） of the bond of Lateolabrax japonicus C. were strdied.The denaturation temperature （Td） of collagens were researched by viscosity of collagen solution.The Td of ASC and PSC from bone were 25～30 ℃ and 30～35 ℃，respectively.Electrophoretic patterns of collagens from bone were high purity Collagen type Ⅰ， hydroxyproline and proline were lower the ASC than the PSC.which was in accordance with the results of composition analysis and Td.

Key words：Acid-soluble collagen， pepsin-soluble collagen， electrophoresis， viscosity， a mino acid