一株多環(huán)芳烴降解菌吉2及其降解能力

齊義彬，李紅，曹美娜，崔慶鋒，俞理，董漢平

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一株多環(huán)芳烴降解菌吉2及其降解能力

齊義彬1，李紅2，曹美娜3，崔慶鋒4，俞理4，董漢平4

（1中國科學(xué)院滲流流體力學(xué)研究所，河北廊坊065007；2新疆油田實驗檢測研究院采收率研究所，新疆克拉瑪依834008；3南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071；4中國石油勘探開發(fā)研究院廊坊分院，河北廊坊065007）

從中原油田毛8區(qū)塊油田采出液中分離得到一株多環(huán)芳烴（PAHs）降解菌吉2，根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化、16S rRNA基因、管家基因和DNA-DNA同源性分析判斷，吉2屬于一株新種。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能在萘和芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，也能夠降解萘、菲、蒽和芘的混合PAHs。7 d對這4種PAHs的降解率分別達(dá)到了61.4%、86.6%、69.9%和18.6%。吉2對原油有很好的降解及降黏作用，7 d原油的降解速率達(dá)到了134 mg·d-1，黏度降低了29.3%。傅里葉變換紅外光譜、族組分和氣相色譜-質(zhì)譜分析顯示吉2能夠優(yōu)先利用原油中含PAHs的芳香烴和膠質(zhì)等組分，原油中萘系列、菲系列、噻吩系列、芴系列、?系列、C21-三芳甾醇、芘和苯并(a)芘的相對含量都有一定程度的降低。實驗結(jié)果表明吉2具有修復(fù)PAHs和原油污染的水體或土壤環(huán)境的能力，為微生物修復(fù)PAHs污染和原油污染提供了一種可行的途徑。

原油；多環(huán)芳烴；微桿菌屬；降解

引 言

多環(huán)芳烴（PAHs）指由2個或2個以上苯環(huán)稠合而成的一類廣泛存在于環(huán)境中的芳香化合物[1]。PAHs是一種普遍存在的環(huán)境污染物，由于它具有廣泛存在性、持續(xù)性、難降解性等性質(zhì)，因此被許多環(huán)境學(xué)家重視而深入研究[2]。PAHs隨著分子量的增加，其生物毒性和基因毒性都逐漸增強，在食物鏈中生物放大效應(yīng)也越來越明顯[3]。最近的研究表明，水生動物患癌性疾病的概率與底泥沉積物中PAHs的濃度密切相關(guān)[4]。由于PAHs具有毒性、致癌性和廣泛存在性等特點，美國環(huán)境保護署（EPA）將16種PAHs列為優(yōu)先污染物[5]。

PAHs可以通過許多方式釋放到環(huán)境中，包括蒸發(fā)、光氧化、化學(xué)氧化、生物富集和吸附在土壤顆粒[6-7]。環(huán)境中PAHs污染物濃度在逐年增加，已威脅到人類的身體健康，在自然界自凈能力的基礎(chǔ)上，人類應(yīng)該通過各種方式促進積累在環(huán)境中的PAHs快速轉(zhuǎn)化降解，修復(fù)被PAHs污染的環(huán)境[8-9]。相比于傳統(tǒng)修復(fù)的方法，生物降解修復(fù)由于具有諸多優(yōu)點，已被開發(fā)為一種高效去除PAHs的技術(shù)[10-11]。生物降解PAHs主要是通過引入降解微生物提高污染物的生物降解速度和程度[12]。目前，大多數(shù)研究集中在發(fā)現(xiàn)具有降解PAHs能力的細(xì)菌，但是已報道的降解微生物大多屬于分枝桿菌屬、白腐菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬以及解環(huán)菌屬等[13-15]，新的高效降解菌株的篩選和研究相對不足；PAHs降解的研究大部分利用單一多環(huán)芳烴如萘或芘作為碳源去表征菌株的降解PAHs的能力[16-17]。而實際情況是，原油污染是環(huán)境中PAHs的主要來源，石油工業(yè)及其相關(guān)地域是環(huán)境中PAHs污染物的主要聚集區(qū)[18]，可以說，菌株在原油中降解能力的測定才是表征菌株環(huán)境修復(fù)能力的重要體現(xiàn)。

因此，本文的核心內(nèi)容是篩選具備降解原油中PAHs的新菌種并評價其降解能力。利用石油膠質(zhì)為碳源篩選PAHs降解菌，對菌株分類鑒定，分析其降解PAHs和去除原油中PAHs能力。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗油水樣 采集樣品包括原油和采出水來自于中原油田毛8區(qū)塊A井，滲透率為0.699mm2，油藏溫度為35℃，采出水礦化度為6199.2 mg·L-1，水質(zhì)為NaHCO3型。原油脫水脫氣后，在35℃下黏度為1036 mPa·s，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量為41.79%。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：K2HPO41.0, KH2PO41.0,NaNO34.0,MgSO40.5，(NH4)2SO42.0, 酵母粉0.2，pH 6.8～7.2, 121℃滅菌30 min。LB培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，pH 6.8～7.2, 121℃滅菌30 min。加入2%瓊脂粉制成LB平板。

1.1.3 實驗菌株DSM 12966和DSM 13468，兩株菌均為標(biāo)準(zhǔn)化模式菌株。由德國ZALF中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 原油中膠質(zhì)提取 將一定體積的A井原油溶解于15倍體積的正庚烷中，1000 r·min-1離心10 min，沉淀物質(zhì)即為瀝青質(zhì)。將上清液取出，并按照2 g·ml-1原油加入細(xì)孔硅膠，用攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?000 r·min-1離心5 min分離硅膠，然后用苯?jīng)_洗吸附了膠質(zhì)的硅膠，直到?jīng)_洗液為淺黃色。最后用含7%甲醇的二氯甲烷溶液沖洗，直到?jīng)_洗液接近無色。將苯?jīng)_洗液及含甲醇的二氯甲烷沖洗液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑，真空干燥，剩余的黑色物質(zhì)即為石油膠質(zhì)[19]。石油膠質(zhì)是由不同高分子化合物組成的混合物，其中的化合物大部分屬于PAHs[20]，可用于篩選PAHs降解菌。

1.2.2 富集培養(yǎng)及PAHs降解菌的篩選 配制以2 g石油膠質(zhì)為唯一碳源的100 ml無機鹽培養(yǎng)基并接種10 ml A井水樣，35℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d直至膠質(zhì)乳化，將5%富集培養(yǎng)基接種到新鮮的含2%膠質(zhì)的無機鹽培養(yǎng)基中，重復(fù)馴化3次。將0.1 ml的富集培養(yǎng)基用無菌水稀釋到10-5、10-6、10-7。取100ml涂覆到LB平板上，35℃培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)和大小不同的單菌落，并對它們的乳化膠質(zhì)的能力進行單獨測定，選取乳化能力最佳的菌株。

1.2.3 菌株培養(yǎng) 將篩選菌株接種到100 ml無機鹽培養(yǎng)基+2 g石油膠質(zhì)中，發(fā)酵時間為72 h，培養(yǎng)溫度為35℃，接種量為5%，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

1.2.4 DNA提取 將待DNA同源性分析的菌株在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中后期（12 h），5000 r·min-14℃離心10 min收集菌體，參照文獻[21]的方法提取微生物基因組。DNA純度要求260:280:230=1.0:0.515:0.450，濃度要求260>2.0。

1.2.5 16S rRNA基因種屬鑒定 采用引物8F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和引物1541R（5′-AAGGAGGTGATCCA GCC-3′），擴增其16S rRNA 基因，并連接到EASY-T3載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將插入片段大小正確（約1.5 kb）的陽性克隆送到上海美吉生物科技有限公司測序。PCR條件為：94℃，5 min；94℃，45 s；55℃，45 s；72℃90 s；30個循環(huán)；72℃，10 min，4℃保存。

1.2.6 DNA-DNA同源性分析 用超聲波破碎法把DNA樣品破碎成為2×105～5×105之間小片段。用0.1×SSC準(zhǔn)確配制成260=1.5～2.0范圍內(nèi)的某一吸光值。參照文獻[22]利用吸光度法測定菌株DNA之間的同源性。

1.2.7 管家基因、、、擴增及測序 參照文獻[23]中設(shè)計的引物與PCR方法，擴增、、、基因。PCR 反應(yīng)體積為50ml, PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, 利用膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物?；厥誔CR產(chǎn)物送到上海美吉生物科技有限公司測序。

1.2.8 微生物PAHs降解能力的測定方法 評價微生物降解單一PAHs（萘和芘）以及PAHs混合物（萘、菲、蒽和芘）的能力。將2 ml吉2發(fā)酵液接種到以單一PAHs（萘和芘，濃度為500 mg·L?1）為唯一碳源的100 ml無機鹽培養(yǎng)基中。恒溫?fù)u床150 r·min-135℃振蕩培養(yǎng)。分別在0、3、7、10、14 d測定PAHs的濃度，用分光光度計600條件下測定微生物菌體的光密度。將2 ml微生物發(fā)酵液接種以PAHs混合物（萘、菲、蒽和芘，每種PAH的濃度為500 mg·L?1）為碳源的100 ml無機鹽培養(yǎng)基中[24]。以上實驗以不接種微生物的無機鹽培養(yǎng)基恒溫?fù)u床150 r·min-135℃振蕩培養(yǎng)7 d作為對照。用乙酸乙酯提取降解后培養(yǎng)基中的PAHs并用GC-FID對剩余量進行定量分析[25]。由于實驗用的PAHs會有一定的風(fēng)化作用，因此實驗中微生物的降解率為去除對照組風(fēng)化比例后的降解百分比。

1.2.9 微生物對原油的降解和降黏能力的測定方法

將微生物發(fā)酵液以5%的接種量接種于含2 g原油的100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)移搖瓶內(nèi)的所有原油和培養(yǎng)基到預(yù)先稱重的250 ml離心杯中，8000 r·min-1離心10 min后，除去培養(yǎng)基和菌體。40℃溫箱烘干到恒重并稱重，根據(jù)離心杯的質(zhì)量變化計算原油降解速率[26]。50 ml微生物發(fā)酵液與50 g中原油田A井原油混合后[27], 35℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，將振蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵體系8000 r·min-1離心10 min收集原油并電脫水干燥。采用Brookfield LVDV-Ⅲ提桶黏度計測量黏度。

1.2.10 原油的傅里葉紅外光、族組分和氣相色譜質(zhì)譜分析 將微生物降解前后的A井原油電脫水后，取5 mg原油與KBr一起研磨壓片，采用FTS-40傅里葉紅外光譜[28]儀掃描，掃描波數(shù)為400～4000 cm-1。根據(jù)硅膠-氧化鋁雙吸附法（SY/T5119－2008）分析微生物降解前后原油中族組分含量的變化[29]。根據(jù)原油和沉積有機質(zhì)烴類氣相色譜分析方法（SY/T 5779—2008）分析微生物降解前后PAHs相對含量變化[30]。色譜條件：安捷倫7890-5975c氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫，圣克拉拉，加州，美國)；色譜柱：HP-5MS 彈性石英毛細(xì)柱（60 m×0.25 mm×0.25 m）；載氣為氦氣（純度為99.999%）；載氣流速，1 ml·min-1；進樣口：300℃。程序升溫：初溫柱溫50℃保持1 min，再以15℃·min-1升至120℃，以3℃·min-1升至300℃，保持25 min。質(zhì)譜：EI 源，絕對電壓1047 V；全掃描。

1.2.11 核苷酸序列NCBI登記信息 將文中測序基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，其登陸編號如下：16S rRNA（KJ627769），（KM457100），（KM457098），（KM457099），（KM457101）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的描述與種屬鑒定

經(jīng)分離純化獲得一株能夠降解PAHs的菌株，編號為吉2。在LB平板上，吉2菌落表面扁平、不透明、邊緣整齊、黃色。吉2菌體革蘭染色呈陽性，桿狀，大小為（1.0～4.0）mm×（0.4～0.8）mm。最適生長溫度為35℃。

將測序得到的16S rRNA以及管家基因、、、與NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取與基因序列同源性最高的模式菌株的標(biāo)準(zhǔn)序列，通過Neighbor-Joining算法構(gòu)建各基因系統(tǒng)發(fā)育樹。其結(jié)果如圖1所示。

吉2與DSM 12966和DSM 13468的16S rRNA相似度均為99%，但是吉2管家基因、、、與各模式菌株的管家基因的最高相似度均低于91%(圖1)。DNA-DNA同源性分析表明吉2與DSM 12966 DNA同源性為39.8%，與DSM 13468 DNA同源性為43.7%。根據(jù)國際細(xì)菌學(xué)分類委員會的建議DNA-DNA同源性≥70%為確定新種的最低標(biāo)準(zhǔn)[31]。吉2屬于一株新種。

2.2 PAHs為唯一碳源的微生物降解

sp.nov吉2能夠以萘和芘為唯一碳源進行生長。以萘和芘為唯一碳源的生長曲線和對萘和芘的降解率如圖2所示。從圖中可以看出，吉2在培養(yǎng)第3 d時萘降解率達(dá)到了59.5%，培養(yǎng)7 d時降解率達(dá)到63.1%。由于萘具有揮發(fā)性，此時對照組7 d萘的風(fēng)化比例達(dá)到37.9%。吉2也能夠降解4環(huán)的PAH芘，14 d芘的降解率為46.5%，對照組風(fēng)化比例為5.0%。

吉2也能夠利用PAHs混合物（萘、菲、蒽和芘）作為唯一碳源。其降解PAHs混合物的效果如表1所示。吉2對這4種PAHs具有不同的降解能力。3 d萘的降解率達(dá)到了56.7%以上，7 d萘降解率達(dá)到了61.4%，7 d對菲、蒽、芘的降解率也分別達(dá)到了86.6%、69.9%和18.6%。可以發(fā)現(xiàn)，PAHs分子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，吉2的降解率越低。

表1 吉2在無機鹽培養(yǎng)基中對PAHs混合物（萘、菲、蒽和芘）的降解率Table 1 Naphthalene, phenanthrene, anthracene and pyrene removal rate in inorganic salt culture medium inoculated with Microbacterium sp. JI 2/%

2.3 微生物對原油中PAHs的降解

菌株吉2對原油有很好的降解及降黏作用，7 d后原油的降解速率為134 mg·d-1，黏度降低了29.3%。傅里葉紅外光譜（IR）分析降解前后原油如圖3所示，由于原油不同組分中相同官能基團的吸收特征會重疊在相同波數(shù)段上，各吸收峰與單一原油組分的對應(yīng)解釋是十分困難的，只能從吸收峰的變化對應(yīng)官能基團量的變化解釋降解效果。降解后，一個大而寬的吸收峰出現(xiàn)在3405.38 cm-1處，這是分子間O—H氫鍵的特征吸收峰。說明原油組分的氧化降解程度的提高。一個在1652.01 cm-1附近的吸收峰明顯增高，這是苯環(huán)的特征吸收峰，表明部分PAHs被降解成單一苯環(huán)及其衍生物。此外一系列吸收峰出現(xiàn)在700～1300 cm-1，說明在原油降解的過程中出現(xiàn)了如羥基和甲基等新的官能團[32-33]。

降解前后原油族組分分析結(jié)果如圖4所示。為確保分析結(jié)果的可靠性，所有原油族組分分析的回收率均在90%以上。結(jié)果表明，吉2降解后原油中芳香烴的含量從26.4%降低到19.93%。膠質(zhì)的含量也降低了2.57%。然而飽和烴的含量卻沒有明顯變化，這說明吉2能夠降解原油中的芳香烴和膠質(zhì)。由于膠質(zhì)和芳香烴的含量與原油的黏度相關(guān)[34]，這與降解后原油黏度降低相吻合。同時，也說明該菌株具有特殊的碳源底物偏好性，相比于飽和烴優(yōu)先降解芳香烴等PAHs。

吉2降解后原油中芳香烴的氣相色譜-質(zhì)譜分析如圖5所示，結(jié)果表明，原油中萘系列、菲系列、噻吩系列、芴系列、?系列、C21-三芳甾醇、芘和苯并(a)芘的相對含量有所降低。說明吉2對原油中PAHs具有較強的降解作用。

3 討 論

3.1 高效PAHs降解菌株的篩選

篩選具備降解PAHs能力的高效菌種一直是該領(lǐng)域的研究重點[35]。在本文中，以石油膠質(zhì)為唯一的碳源從油田采出水中篩選到一株能夠以PAHs為碳源生長的菌株吉2，16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為該菌屬于，而之前的研究中關(guān)于該屬PAHs降解能力的報道很少。吉2是一株高效PAHs降解菌，在無機鹽培養(yǎng)基中7 d對萘、菲、蒽和芘的降解率分別達(dá)到了61.4%、86.6%、69.9%和18.6%。而且管家基因和DNA同源性分析認(rèn)為吉2屬于一株新種。深入研究該菌降解途徑，可能為微生物修復(fù)PAHs污染提供了新的可行途徑。

3.2 降解原油污染環(huán)境中的PAHs

石油工業(yè)的快速發(fā)展也引起了石油污染的蔓延，尤其是對土壤及水體的污染。近年來，石油己經(jīng)成為土壤環(huán)境和水體環(huán)境的主要污染物之一。Toledo等[36]認(rèn)為環(huán)境中的PAHs主要是由石油、煤炭、紙張、作物秸稈等不完全燃燒以及在還原狀態(tài)下熱分解而產(chǎn)生的，特別是化石燃料的燃燒是環(huán)境中PAHs的主要來源。Juhasz等[37]認(rèn)為原油污染土壤和水體中含有高濃度的PAHs。因此對原油污染環(huán)境中PAHs的降解是減少PAHs污染的一個重要部分。然而在通常情況下，微生物降解烴類按照從易到難的順序：短鏈正構(gòu)烷烴>長鏈正構(gòu)烷烴>長鏈異構(gòu)烷烴>環(huán)烷烴>芳香烴>雜環(huán)碳?xì)浠衔?瀝青質(zhì)[38]。本文結(jié)果表明sp.nov吉2能夠降解原油中的芳香烴和膠質(zhì)。

4 結(jié) 論

（1）以石油膠質(zhì)為唯一碳源從中原油田油井采出水中篩選到一株能夠降解PAHs的菌株吉2。16S rRNA，管家基因和DNA同源性分析認(rèn)為吉2 屬于一株新種。

（2）吉2能夠在以萘和芘為碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，利用萘和芘為唯一的碳源和能源。7 d對萘的降解率達(dá)到了63.1%，14 d對芘的降解率達(dá)到了46.5%。吉2在無機鹽培養(yǎng)基中也能夠降解萘、菲、蒽和芘的混合PAHs，7 d對這4種PAHs的降解率達(dá)到了61.4%、86.6%、69.9%和18.6%。

（3）菌株吉2對原油有很好的降解及降黏作用，7 d原油的降解速率達(dá)到了134 mg·d-1，黏度降低了29.3%。傅里葉紅外﹑族組分和氣相色譜-質(zhì)譜分析吉2能夠優(yōu)先利用原油中含PAHs的芳香烴和膠質(zhì)等組分。原油中萘系列、菲系列、噻吩系列、芴系列、?系列、C21-三芳甾醇、芘和苯并(a)芘的相對含量都有不同程度的降低。

（4）吉2能同時降解水體中多種PAHs，也能降解原油中多種PAHs，為生物修復(fù)PAHs污染物和環(huán)境原油污染提供了一種可行的途徑。

References

[1] Gu Z P, Feng J L, Han W L, Li L, Wu M H, Fu J M, Sheng G. Diurnal variations of polycyclic aromatic hydrocarbons associated with PM2.5 in Shanghai, China [J]., 2010, 22(3): 389-396

[2] Chen B L, Wang Y S, Hu D F. Biosorption and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous solutions by a consortium of white-rot fungi [J]., 2010, 179: 845-851

[3] Hu Yanjun (胡艷軍), Guan Zhichao (管志超), Zheng Xiaoyan (鄭小艷). Analysis on polycyclic aromatic hydrocarbons in pyrolysis oil from municipal wastewater sewage sludge [J].(化工學(xué)報), 2013, 64(6): 2227-2231

[4] Quan X C, Tang Q, He M C, Yang Z F, Lin C Y, Guo W. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments from the Daliao River watershed, China [J]., 2009, 21: 865-871

[5] Guo C L, Zhou H W, Wong Y S, Tam N F Y. Isolation of PAH-degrading bacteria from mangrove sediments and their biodegradation potential [J]., 2005, 51: 1054-1061

[6] Ding J, Cong J, Zhou J, Gao S X. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation and extracellular enzyme secretion in agitated and stationary cultures of[J]., 2008, 20: 88-93

[7] Zhao H P, Wang L, Ren J R, Li Z, Li M, Gao H W. Isolation and characterization of phenanthrene-degrading strainssp. ZP1 andsp. ZP5 [J]., 2008, 152: 1293-1300

[8] Ji Aimin (姬愛民), Zhang Shuting (張書廷), Xu Hui (徐暉), Li Haiying (李海英), Zhang Huanxin (張煥鑫). Composition and fuel characters of gasoline-like fraction in the pyrolysis oil of sludge [J].(染料化學(xué)學(xué)報), 2011, 39 (3): 194-197

[9] Anjali J, Fulekar M H. Biodegradation of phenanthrene using adapted microbial consortium isolated from petrochemical contaminated environment [J]., 2011, 187: 333-340

[10] Haritash A K, Kaushik C P. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): a review [J]., 2009, 169: 1-15

[11] Muckian L M, Grant R J, Clipson N J W, Doyle E M. Bacterial community dynamics during bioremediation of phenanthrene- and fluoranthene-amended soil [J]., 2009, 63: 52-56

[12] Shao Z Z, Cui Z S, Dong C M, Lai Q L, Chen L. Analysis of a PAH-degrading bacterial population in subsurface sediments on the Mid-Atlantic Ridge [J]., 2010, 157: 724-730

[13] Zhang Z Z, Gai L X, Hou Z W, Yang C Y, Ma C Q, Wang Z G, Sun B P, He X F, Xu H Z. Characterization and biotechnological potential of petroleum-degrading bacteria isolated from oil-contaminated soils [J]., 2010, 101: 8452-8456

[14] Gao P K, Li G Q, Dai X C, Dai L B, Wang H B, Zhao L X, Chen Y H, Ma T. Nutrients and oxygen alter reservoir biochemical characters and enhance oil recovery during biostimulation [J]., 2013, 55: 987-993

[15] Jacques R J S, Okeke B C, Fatima M B, Aline S T, Maria C R P, Flavio A O C. Microbial consortium bioaugmentation of a polycyclic aromatic hydrocarbons contaminated soil [J]., 2008, 99: 2637-2643

[16] Tony H, Sanro T, Kazutaka I. Biodegradation of chrysene, an aromatic hydrocarbon bysp. S133 in liquid medium [J]., 2009, 164: 911-917

[17] Lin Y, Cai L X. PAH-degrading microbial consortium and its pyrene-degrading plasmids from mangrove sediment samples in Huian, China [J]., 2008, 57: 703-706

[18] Young M K, Chi K A, Seung H W, Gyoo Y J, Jong M P. Synergic degradation of phenanthrene by consortia of newly isolated bacterial strains [J]., 2009, 144: 293-298

[19] Chen Yuxiang (陳玉祥), Chen Jun (陳軍), Pan Chengsong (潘成松), Li Gang (李剛),Xiao Xiqing (肖喜慶),. Influence of asphaltenes and resins on the stability of heavy crude emulsions [J].(應(yīng)用化工), 2009, 38 (2): 194-200

[20] Li Xiaobin (李曉斌), Sun Yujiao (孫寓姣), Wang Hongqi (王紅旗), Ding Aizhong (丁愛中). Analysis of PAH-degrading bacteria from contaminated soil at a coking plant [J].(化工學(xué)報), 2010, 61(2): 477-483

[21] Zhao Lingxia (趙玲俠), Gao Peike (高配科), Cao Meina (曹美娜), Gao Mengli (高夢黎), Li Guoqiang (李國強), Zhu Xudong (朱旭東), Ma Ting (馬挺). Research on population structure and distribution characteristic of indigenous microorganism in post-polymer-flooding oil reservoir [J].(環(huán)境科學(xué)), 2012, 33(2): 289-296

[22] Yan Aimin (閻愛民), Chen Wenxin (陳文新). DNA-DNA hybridization analysis of three new rhizobia groups [J].(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報), 2000, 5(1): 14-20

[23] Richert K, Brambilla E, Stackebrandt E. The phylogenetic significance of peptidoglycan types: molecular analysis of the generaandbased upon sequence comparison of,,andand 16S rRNA genes [J]., 2007, 30: 102-108

[24] Qi Yibin (齊義彬), Cao Meina (曹美娜), Huang Lixin (黃立信), Yu Li (俞理), Xiu Jianlong (修建龍). Mechanism of crude oil viscosity reduction and degradation by thermophilic hydrocarbon-degrading bacteria combination [J].(科學(xué)技術(shù)與工程), 2014, 14(24): 18-22

[25] Guo Chuling, Guo C L, Zhou H W, Wong Y S, Tam N F Y. Biodegradation ability and dioxgenase genes of PAH-degradingandstrains isolated from mangrove sediments [J]., 2010, 64: 419-426

[26] Qi Yibin (齊義彬), Wang Dawei (王大威), Wu Mengmeng (吳萌萌), Lü Xin (呂鑫), Li Guoqiang (李國強), Ma Ting (馬挺). Effect of resins degradation and biological emulsification in decreasing heavy oil viscosity [J].(石油學(xué)報), 2012, 33(4): 670-675

[27] Gao Peike (高配科), Wang Yansen (王燕森), Zhang Hongzuo (張宏祚), Pan Xiaoxuan (潘曉軒), Li Guoqiang (李國強), Ma Ting (馬挺). Mechanism of crude oil viscosity reduction by two thermophilic hydrocarbon-degrading bacteria [J].(化工學(xué)報), 2013, 64 (11): 4240-4245

[28] Moh M H, Cheman Y B, Voort F R, Abdullah W J W. Determination of peroxide value in thermally oxidized crude palm oil by near infrared spectroscopy [J]., 1999, 76: 19-23

[29] SY/T 5119—2008[R]

[30] SY/T 5779—2008[R]

[31] Zhu C J, Sun G P, Chen X J, Guo J, Xu M Y.sp. nov., an endospore-forming bacterium with a filament-to-rod cell cycle [J]., 2014, 64: 3644-3649

[32] Chen B L, Wang Y S, Hu D F. Biosorption and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous solutions by a consortium of white-rot fungi [J]., 2010, 179: 845-851

[33] Jain P S, Bari S B, Surana S J. Isolation of stigmasterol and γ-sitosterol from petroleum ether extract of woody stem of abelmischus manihot [J]., 2009: 1767-1773

[34] Gao Xin (高鑫), Cai Tingting (蔡婷婷), Zhu Lijun (朱麗君), Zhou Yulu (周玉露), Xiang Yuzhi (項玉芝), Xia Daohong (夏道宏). Content distribution and existing form of Fe in crude and residual oil [J].:(石油學(xué)報：石油加工), 2014, 30 (2): 256-261

[35] Zhao Heping, Wu Q S, Wang L, Zhao X T, Gao H W. Degradation of phenanthrene by bacterial strain isolated from soil in oil refinery fields in Shanghai, China [J]., 2009, 164: 863-869

[36] Toledo F L, Calvo C, Rodelas B J. Selection and identification of bacteria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities[J]., 2006, 29: 244-252

[37] Juhasz A L, Ravendra N. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene [J]., 2000, 45: 57-88

[38] She Y H, Shu F C, Zhang F, Wang Z L, Kong S Q, Yu L J. The enhancement of heavy crude oil recovery using bacteria degrading polycyclic aromatic hydrocarbons//2010 First International Conference on Cellular, Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering (CMBB)[C].2010

A PAH-degrading strain JI 2and its biodegradation potential ability

QI Yibin1，LI Hong2，CAO Meina3，CUI Qingfeng4，YU Li4，DONG Hanping4

(Institute of Porous Flow & Fluid MechanicsCNPC & Chinese Academy of SciencesLangfangHebeiChina；Research Institute of Detection Experimental of Xinjiang OilfieldKaramayXinjiangChina;School of Life SciencesNankai UniversityTianjinChina;Langfang BranchResearch Institute of Petroleum Exploration and DevelopmentLangfangHebeiChina

A PAH-degrading strain JI 2 was isolated from oilfield produced water in Mao 8 block of Zhongyuan Oilfield. According to analysis of morphological observation, physiological and biochemical test, 16S rRNA gene, house-keeping genes and DNA-DNAhybridization, JI 2 was considered to represent a novel species of the genus. The strain could not only grow in inorganicsalt culture medium and utilize naphthalene and pyrene as the sole carbon source, but also degrade mixed naphthalene, phenanthrene,anthracene and pyrene. The four PAHs degradationrates could reach61.4%, 86.6%, 69.9% and 18.6%, respectively after 7 d. The viscosity of crude oil treated with JI 2 decreased by 29.3% and degradation rate was 134 mg·d-1. Fourier transform infrared spectra, group composition and GC-MS analysis of the crude oil treated with JI 2 showed that the strain tended to utilizePAHs in aromatic hydrocarbons andresins in crude oil.The relative contents of naphthalene series, phenanthrenseries, thiophene series, fluorene series and chrysene series, C21-triaromatic steroid, pyrene, and benz(a)pyrene decreased after degradation. JI 2 had the capacity to remediatewaterandsoil environment contaminated by PAHs and oil, and provided a feasibleway for bioremediation ofPAHs and oil pollution.

crude oil；polycyclic aromatic hydrocarbons；；degradation

2014-09-10.

YU Li, yuli69@petrochina.com.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141365

Q 939.97；Q 938.1

A

0438—1157（2015）03—1072—08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2013AA064402）。

2014-09-10收到初稿，2014-11-21收到修改稿。

聯(lián)系人：俞理。第一作者：齊義彬（1985—），男，博士研究生。

supported by the National High Technology Research and Development Program of China (2013AA064402).