前肢畸形WHBE兔前肢骨密度檢測及降鈣素、骨鈣素蛋白表達

陳方明, 林　琳, 蔡月琴, 陳　誠, 陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心, 杭州　310053）

前肢畸形WHBE兔前肢骨密度檢測及降鈣素、骨鈣素蛋白表達

陳方明, 林琳, 蔡月琴, 陳誠, 陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心, 杭州310053）

目的觀察前肢畸形的WHBE （FMWHBE） 兔前肢骨密度和降鈣素（CT）、骨鈣素（又稱γ-羧基谷氨酸蛋白, BGP）蛋白表達水平，探討前肢畸形的可能成因及作為骨生物力學研究的模型動物的可能性。方法分別選取1、2、3、4月齡FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白兔，每個月齡階段各6只。所有實驗兔稱體質量后耳動脈取血檢測血清CT、BGP含量，用小動物成像系統(tǒng)測量前肢肱骨、橈骨、尺骨近心端、中段、遠心端骨密度，并經脫鈣后進行CT、BGP免疫組織化學染色觀察。結果各組實驗兔各月齡體質量無顯著差異。FMWHBE兔肱骨1月齡全段和2月齡近心端、中段及3月齡肱骨遠心端，橈骨1月齡中段和遠心端及2、3月齡的遠心端，尺骨1、2月齡全段及3月齡遠心端骨密度均顯著低于WHBE兔和日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01）。1月齡FMWHBE兔血清CT、BGP含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），2月齡BGP顯著高于日本大耳白兔（P＜0.01），3月齡CT 顯著高于WHBE兔（P＜0.05）。CT、BGP免疫組織化學染色顯示, FMWHBE兔CT表達陽性部位較少，陽性較弱，BGP表達稍弱于WHBE兔和日本大耳白兔。結論FMWHBE兔發(fā)生前肢畸形和骨密度變化可能與其生長發(fā)育過程中趴臥姿態(tài)導致的前肢骨特殊應力及CT、BGP的表達特點有關。

前肢畸形； WHBE兔； 骨密度； 降鈣素； 骨鈣素

WHBE兔（White hair & black eyes rabbit, WHBE）,是本中心從日本大耳白兔中發(fā)現(xiàn)的毛色為白色、眼睛為黑色的實驗兔，現(xiàn)已近交育成封閉群實驗兔，又名日本大耳白兔黑眼系。在育種過程中, 有部分幼年WHBE兔自發(fā)前肢畸形, 表現(xiàn)為1、2月齡開始前肢外展, 無法內收直立, 足部無力支撐, 僅靠前肢整體著地支撐體質量, 呈趴臥姿態(tài)。本實驗檢測了1、2、3、4月齡的前肢畸形WHBE兔（FMWHBE）肱骨、橈骨、尺骨近心端、中段和遠心端骨密度（bone mineral density, BMD），對FMWHBE兔血清和前肢肱骨、橈骨、尺骨降鈣素（CT）、骨鈣素（稱γ-羧基谷氨酸蛋白，BGP）蛋白表水平達進行檢測,并與同期日本大耳白兔、正常WHBE兔進行對比，探討WHBE兔自發(fā)前肢畸形的可能成因，并為探討FMWHBE兔能否作為骨質疏松癥等骨生物力學研究的模型動物提供一定依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

分別選取1、2、3、4月齡FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白兔，每月齡階段各6只，共72只。選取實驗兔體質量為1月齡： 1.0～1.4 kg，2月齡： 1.3～2.1 kg，3月齡： 1.9～2.3 kg，4月齡：2.3～2.7 kg，來源于新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場［SCXK（浙）2009-0042］； 飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級實驗室［SYXK（浙）2008-0116］，飼料鈣、總磷含量分別為1.5%、0.8%，符合GB 14924.3-2010標準。飼養(yǎng)室溫度22±2℃, 相對濕度50%±5%, 12h/12h明暗交替, 光照強度150 lx。1.2主要儀器和試劑

Kodak Image Station小動物成像系統(tǒng)、Thermo Electron Corporation 酶標儀、STP120脫水機、AP280-2包埋機、Leica切片機、Nikon eclipse 80i顯微鏡、Zeiss Image System圖像分析系等。血清CT ELISA試劑盒，批號： R700291L/T、BGP ELISA試劑盒，批號： R907871L/T； 進口脫鈣液，批號： 20999, 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；一抗： Anti-Calcitonin antibody （CT），兔單克隆抗體，批號： GR50372-1, abcam公司； Anti-Osteocalcin antibody（BGP）, 小鼠單克隆抗體, 批號： GR178730-1, abcam公司；二抗：Super Picture 3rd Gen IHC Detection Kit，批號：1289835A，Invitrogen公司。1.3實驗方法

將FMWHBE、WHBE兔組和日本大耳白兔組（JPW）各月齡實驗兔稱體質量并記錄，耳動脈取血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，用ELISA法檢測血清CT、BGP含量； 體積分數(shù)3%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉處死各組實驗兔，立即取前肢，用小動物成像系統(tǒng)X射線成像后測量肱骨、橈骨、尺骨近心端、中段、遠心端骨密度。分離前肢肌肉后用體積分數(shù)10%中性甲醛固定, 快速脫鈣1周后進行包埋、切片、免疫組織化學染色。免疫組織化學兩步法染色方法： 切片脫蠟至水, 蒸餾水洗2 min； 置枸櫞酸鹽緩沖液中高壓熱修復1 min；體積分數(shù)3% H2O2溶液滅活過氧化物酶10 min； PBS 洗5 min×3次； 滴加一抗, 稀釋濃度均為1∶100, 37 ℃孵育60 min； PBS洗5 min×3次； 滴加二抗, 37 ℃孵育15 min； PBS洗5 min×3次； DAB顯色2 min,復染、透明后封片。結果判斷： 陽性表達呈黃色或棕黃色。

骨質疏松判斷標準： Kodak Image Station自帶圖像分析軟件對X光成像后的前肢骨進行骨密度測量。根據(jù)文獻，采用同齡正常動物BMD值作為對照，以BMD統(tǒng)計學分析結果顯著降低作為骨質疏松癥的判斷標準［1-3］。

1.4統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1實驗兔前肢X射線成像

X射線成像見FMWHBE兔前肢橈骨、尺骨畸形（圖1）。

2.2實驗兔不同月齡體質量

各組實驗兔1、2、3、4月齡體質量未見明顯差異（表1）。

2.3實驗兔不同月齡前肢肱骨、橈骨、尺骨骨密度

圖1　三種實驗兔前肢X射線成像（1月齡）Figure 1　ray image of the fore limb in rabbits （1 month old）

表 1　實驗兔不同月齡體質量Table 1　Changes of the body weight in rabbits at different ages　　　　　　　　　　　　　　kg

1月齡FMWHBE兔肱骨近心端、中段、遠心端骨密度均顯著低于WHBE兔和日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)MWHBE兔2月齡近心端、中段和3月齡肱骨遠心端骨密度顯著低于WHBE兔和日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01）； WHBE兔2月齡肱骨遠心端和4月齡肱骨中段骨密度顯著高于日本大耳白兔組（P＜0.05）（表2）。

1月齡FMWHBE兔橈骨中段和遠心端、2、3月齡的遠心端骨密度均顯著低于WHBE兔和日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01）； WHBE兔橈骨3月齡的中段和4月齡的近心端骨密度顯著低于日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01）（表3）。

表4結果顯示： 1、2月齡FMWHBE兔尺骨近心端、中段、遠心端及3月齡遠心端骨密度均顯著低于WHBE兔和日本大耳白兔組（P＜0.05或P＜0.01）；4月齡WHBE兔尺骨遠心端骨密度顯著高于WHBE兔組（P＜0.05）（表4）。

2.4實驗兔血清CT、BGP水平

1月齡FMWHBE兔血清CT顯著低于日本大耳白兔組和WHBE組（P＜0.05），BGP顯著低于WHBE組（P＜0.05），2月齡FMWHBE兔血清BGP顯著高于日本大耳白兔組（P＜0.05），3月齡CT顯著高于WHBE兔組（P＜0.05）（表5）。

2.5實驗兔前肢肱骨、橈骨、尺骨CT、BGP蛋白表達情況

各組實驗兔前肢肱骨、橈骨、尺骨均可見CT表達，陽性物質呈黃色或淡黃色，骨小管周圍及新生骨組織可見大量陽性物質高表達。與WHBE兔和日本大耳白兔比較，F(xiàn)MWHBE兔前肢肱骨、橈骨、尺骨CT表達陽性部位較少，面積較小，陽性較弱（圖2A、B、C）。各組實驗兔前肢肱骨、橈骨、尺骨均可見BGP表達，陽性物質呈黃色或淡黃色，主要分布于骨小管周圍及新生骨組織，后者可見大量陽性物質表達。FMWHBE兔前肢肱骨、橈骨、尺骨BGP表達陽性部位較少，局部面積較小，陽性稍弱于WHBE兔和日本大耳白兔（圖3A、B、C）。

表 2　實驗兔不同月齡前肢肱骨骨密度Table 2　The results of bone mineral density of fore humerus in rabbits at different ages　　　　　g/cm2

表 3　實驗兔不同月齡前肢橈骨骨密度Table 3　The results of bone mineral density of fore radius in rabbits at different ages　　　　　　g/cm2

表 4　實驗兔不同月齡前肢尺骨骨密度結果Table 4　The results of bone mineral density of fore ulna in rabbits at different ages　　　　　　　g/cm2

表 5　實驗兔不同月齡血清CT、BGP水平Table 5　Changes of the levels of serum CT and BGP in rabbits at different ages　　　　　　　　mol/L

3　討論

根據(jù)Wolff定律，骨以最優(yōu)的形式適應其力學環(huán)境，即骨質中的骨細胞能夠感應局部的應力，并據(jù)此調整細胞的成骨、吸收作用［4］。骨是力學敏感性組織，力學載荷作用于骨組織，根據(jù)載荷不同調節(jié)其骨量、結構及力學特征［5］。FMWHBE兔各月齡體質量與WHBE兔和日本大耳白兔未見明顯差異，表明其四肢負重總和未見差異。FMWHBE 兔1、2月齡前肢肱骨、橈骨、尺骨近心端、中段、遠心端都發(fā)生不同程度骨密度降低，存在一定程度的骨質疏松, 而4月齡FMWHBE兔除橈骨近心端骨密度顯著降低外其他各月齡骨密度與WHBE兔和日本大耳白兔未見有明顯差異。FMWHBE兔生長發(fā)育過程中1、2月齡前肢趴臥，其前肢尺骨、橈骨、肱骨應力和應變可能異常，結合病理學檢查結果其局部新生骨組織較少, 提示FMWHBE 兔1、2月齡骨密度降低可能和其生長發(fā)育過程中1、2月齡逐漸形成的趴臥姿態(tài)有關，而后期隨著體質量增加，其前肢應力和應變加大，根據(jù)力學調控體系理論，前肢骨骨量增加以適應前肢載荷。

CT 通過直接抑制破骨細胞的活性和增加尿中的鈣、磷排泄降低血鈣和血磷，使破骨細胞迅速停止代謝。CT可以促進骨的形成和礦化過程，有研究認為CT具有抑制成骨細胞凋亡的作用，CT治療糖皮質激素誘發(fā)的骨質疏松，其作用機制部分是由于抑制成骨細胞和骨細胞凋亡的結果［6］。BGP，是成骨細胞合成和分泌的一種激素樣多肽，具有骨代謝調節(jié)激素作用，是反映骨更新狀態(tài)和骨形成的一種特異性指標［7,8］。BGP可與鈣和羥磷灰石結合而使骨礦化，具有維持骨的正常礦化速率、抑制異常羥磷灰石結晶形成的作用。BGP大多沉積于骨基質， 三分之一進入血液循環(huán)。因此血清中骨鈣素濃度可特異性地反映成骨細胞的活性，用于判斷成骨細胞活性受抑制的程度，是骨形成功能的良好標志。由于在骨吸收過程中，基質中的骨鈣素又可釋放到血液，因此，骨鈣素是評價骨形成和骨轉換率的特異性指標。在骨質合成時，血清骨鈣素可以增高, 若骨鈣素水平下降，則提示成骨細胞活性下降及骨轉移率降低［9］。本實驗FMWHBE兔1月齡血清CT和BGP均顯著降低，而2月齡BGP、 3月齡CT顯著升高，組織免疫組織化學結果顯示CT表達較WHBE兔和JPW兔弱，BGP陽性表達亦較低，提示FMWHBE兔1月齡骨形成較慢。結合1至4月齡骨密度變化，F(xiàn)MWHBE兔1、2月齡骨密度較低而4月齡骨密度增加可能與CT和BGP的特異性表達有關。

A： FMWHBE肱骨；　B： FMWHBE橈骨；　C： FMWHBE尺骨；　D： WHBE肱骨；　E： WHBE橈骨；　F： WHBE尺骨；　G： JPW肱骨；　H： JPW橈骨；　I： JPW尺骨A： FMWHBE humerus； B： FMWHBE radius； C： FMWHBE ulna；　D： WHBE humerus；　E： WHBE radius；　F： WHBE ulna；G： JPW humerus； H： JPW radius； I： JPW ulna

綜上所述, FMWHBE兔前肢畸形和骨密度變化可能與其生長發(fā)育過程中趴臥姿態(tài)導致的前肢骨特殊應力及CT、BGP的表達特點有關。FMWHBE兔可作為潛在骨生物力學模型動物進一步研究。

［1］Liu X, Lei W, Wu Z, et al. Effects of glucocorticoid on BMD, micro-architecture and biomechanics of cancellous and cortical bone mass in OVX rabbits［J］. Med Eng Phys, 2012, 34（1）：2-8.

［2］郭磊. 恒古骨傷愈合劑對骨質疏松兔力學及微結構影響的基礎研究［D］. 昆明： 昆明醫(yī)科大學, 2014.

［3］方忠, 楊琴, 李鋒, 等.去勢法兔骨質疏松模型建立的探討［J］. 中國骨質疏松雜志, 2005, 11（2）：202- 205.

［4］Wolff J. Das gesetz der Transformation de Knochen［M］. Berlin：Springer-Verlag,1892.

［5］Van C Mow, Rih Huiskes. 骨科生物力學暨力學生物學［M］.湯婷婷等譯. 濟南：山東科學出版社, 2009：138-145.

［6］Plotkin LI, Weinstein RS, Parfitt AM, et al. Prevention of osteocyte and osteoblast apoptosis by bisphosphonates and calcitonin［J］. J Clin Invest,1999,104 （10）：1363.

［7］王月, 呂志偉, 張?zhí)煊? 辛伐他汀對骨髓基質干細胞成骨分化晚期骨鈣素表達的影響［J］. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志, 2014, 17（7）：1135-1137.

［8］Power MJ, FottellPF. Osteocalcin diagnostic methods and clinical applications［J］. Crit Rev Clin Lab Sci,1991, 28：287-335.

［9］張玲莉, 陳炳霖, 鄒軍. 運動影響骨轉換, 促進或抑制骨細胞、破骨細胞的發(fā)育和活性［J］.中國組織工程研究, 2014, 18（42）：6838-6843.

The Forelimb Bone Mineral Density and Expression of Calcitonin and Osteocalcin in Forelimb Malformed White Hair & Black Eyes Rabbits

CHEN Fang-ming, LIN Lin, CAI Yue-qin, CHEN Cheng, CHEN Min-li
（The Research Center of Animal Experiment， Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310053， China）

ObjectiveTo observe bone mineral density and expression level of calcitonin （CT）, osteocalcin （also named bone gla protein, BGP） proteins in forelimb malformation WHBE rabbits （FMWHBE） and to explore possible cause of forelimb malformation and possibility to be an animal model for bone biomechanical studies. MethodFMWHBE rabbits, WHBE rabbits and Japan white rabbits （JW） at 1, 2, 3 and 4 months of age were selected with six rabbits for each age. Contents of CT, BGP in serum were detected after body weighing and a small animal imaging system was used to measuring bone mineral density of proximal end, middle end and telecentric end in forelimb humerus, radius and ulna. CT and BGP immunohistochemical staining were used for pathological observation after decalcification. ResultNo significant difference of body weights of each month old was observed among all groups. Bone mineral density of whole length in 1 month old and proximal end, middle end in 2 months old and telecentric end in 3 months old of humerus, middle end and telecentric end in 1 month and telecentric end in 2 and 3 months old of radius and whole length in 1 and 2 months old and telecentric end in 3 months old of ulna in FMWHBE rabbits were notably lower than that in WHBE and JW rabbits （P＜0.05 or P＜0.01）. CT and BGP contents in serum of 1 month old FMWHBE were notably decreased （P＜0.05 or P＜0.01）. BGP level in 2 months old was obviously higher than that of in JW rabbits （P＜0.01）. CT level in 3 month olds was notably higher than that in WHBE rabbits （P＜0.05）. Immunohistochemical staining of CT, BGP showed that positive parts of CT expression in FMWHBE rabbit was less and weaker, and expression of BGP in FMWHBE rabbits was slightly weaker than that in JW rabbits and WHBE rabbits. ConclusionForelimb malformation formation and bone mineral density changes in FMWHBE rabbits may be related with the special stress in forelimb bones and expression character of CT and BGP induced by lying posture during growth.

Forelimb malformed； WHBE rabbits； Bone mineral density； Calcitonin （CT）；Osteocalcin （BGP）

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0383-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.008

2014-12-11

1. 浙江省科技廳公益性（動物平臺）項目（2012C37079） 2. 浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2008B137）

陳方明（1981-）, 男, 實驗師, 研究方向： 實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail： 28483001@qq.com

陳民利（1963-）, 女, 教授, 研究方向為實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail： cmli991@aliyun.com