• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蓮霧果實高質(zhì)量總RNA提取方法的建立

    2015-10-14 00:52:24尹珍珍吳光斌陳發(fā)河謝潮添
    食品科學(xué) 2015年14期
    關(guān)鍵詞:蓮霧清液條帶

    尹珍珍,吳光斌,陳發(fā)河,*,謝潮添

    (1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門 361021)

    蓮霧果實高質(zhì)量總RNA提取方法的建立

    尹珍珍1,吳光斌1,陳發(fā)河1,*,謝潮添2

    (1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門 361021)

    為從蓮霧果實中提取高質(zhì)量RNA,以“黑珍珠”蓮霧果實為材料,采用試劑盒法、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法、改良CTAB法和Trizol法5 種總RNA提取方法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明,SDS法得到的總RNA質(zhì)量較差,有嚴(yán)重的降解和DNA污染;Trizol法提取物中有較多蛋白和多糖等殘留,無條帶出現(xiàn)。CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法均能獲得質(zhì)量較好的蓮霧果實總RNA,經(jīng)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證得到條帶與目的片段大小一致,表明該RNA均能滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究。

    蓮霧果實;RNA提??;多糖;多酚;方法

    從不同植物組織和器官中提取完整性好、高純度的RNA是進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建、Northern分析實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和新一代測序(如RNA-seq)等許多分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。由于不同組織結(jié)構(gòu)與所含成分的差異,其RNA最適提取方法也不盡相同[1]。尤其對于富含蛋白質(zhì)、多糖多酚類物質(zhì)的植物果實組織,且核糖核酸酶(RNase)水平較高,這些因素作用下難以從果實中獲得高質(zhì)量RNA[2-4]。目前已有通過研究改進(jìn)不同的提取方法,成功從獼猴桃[5]、葡萄[6-9]、蘋果[6,10]、香蕉[11]、菠蘿[12]、枇杷[13-14]、越橘[15-16]、李[17]和番茄[18]等果實中提取得到高質(zhì)量RNA的報道。蓮霧(Syzygium samarangense Merr. et Perry)是熱帶、南亞熱帶地區(qū)重要珍稀果樹之一,其果實風(fēng)味獨特,富含蛋白質(zhì)、VC、糖類、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì),具有除痰、潤肺、止咳、涼血等功效,深受大眾喜愛。而目前以蓮霧果實為材料進(jìn)行高質(zhì)量RNA提取的方法目前未見有報道。

    本研究以成熟蓮霧果實為材料,采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法、改良CTAB法、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法、Trizol法和適合多糖多酚植物RNA提取試劑盒法提取蓮霧果實組織總RNA,探索和建立最適宜蓮霧果實總RNA的提取方法,為蓮霧分子生物學(xué)研究的開展提供基本的技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    臺灣“黑珍珠”蓮霧(Syzygium samarangense Merr. et Perry)果實 廈門臺灣水果集散中心。

    二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)北京索萊寶科技有限公司;Plant RNA Kit RNA提取試劑盒 美國Omega公司;十六烷基三甲基溴化銨、氯化鋰、氯仿(均為分析純) 上海浩然生物技術(shù)有限公司;TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒KR104、2×Taq PCR MasterMix KT201 天根生化科技有限公司。

    1.2儀器與設(shè)備

    5417R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Nanodrop ND-1000分光光度計 凱樂博(北京)科技發(fā)展有限公司;ULT386-3-V40超低溫冰箱 美國Thermo Electron公司;AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺蘇州凈化醫(yī)療設(shè)備有限公司;YXQ.SG41.280壓力蒸汽滅菌鍋 佛山順德格蘭仕微波爐電器有限公司;凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器公司。

    1.3方法

    1.3.1試劑盒法提取總RNA

    參照Omega公司的E.Z.N.A plant RNA Kit試劑盒使用說明提取RNA。

    1.3.2 CTAB法提取總RNA

    取0.5 g新鮮蓮霧果肉放入預(yù)冷的研缽中,加入2%聚乙烯砒咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),用液氮快速研磨至粉末,快速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管中,再加入1 mL 3% CTAB提取液,同時加入2% β-巰基乙醇和20 μL 4 mg/mL蛋白酶K溶液,充分混勻;置65 ℃水浴30min,期間每 5 min振搖1 次。4 ℃、10 000×g離心10 min;取上清液,加入等體積的氯仿-異戊醇溶液(體積比24∶1),混勻后于4 ℃、12 000×g離心15min。取上清液加入1/3體積10 mol/L LiCl溶液,混勻后于-20 ℃條件下沉淀過夜。4 ℃、12 000×g離心30 min,棄上清液,用200 μL 2 mol/L LiCl溶液充分懸浮沉淀,4 ℃、12 000×g離心20 min,棄上清液,重復(fù)1 次。用200 μL 10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.5)在室溫條件下充分懸浮沉淀,加入20 μL 體積 3 mol/L KAc溶液(pH 5.5),冰浴20 min。4 ℃、12 000×g離心15 min,轉(zhuǎn)移上清液于新1.5 mL管中,加入500 μL預(yù)冷的無水乙醇,-70 ℃放置 2~3 h。 4 ℃、12 000×g離心20 min,棄上清液,加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌2次,室溫晾干,用適量DEPC水溶解并置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3改良CTAB法提取總RNA

    取0.5 g新鮮蓮霧果肉,先擠干水分放入預(yù)冷的研缽中,加入2% PVP,用液氮快速研磨至粉末,迅速轉(zhuǎn)入含有1 mL 75%乙醇溶液和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))β-巰基乙醇溶液的2 mL離心管中,混勻,4 ℃、10 000×g離心10 min,棄去上清液,重復(fù)1 次。加入1 mL 3% CTAB提取液,后續(xù)方法同1.3.2節(jié)CTAB法。

    1.3.4 SDS法提取總RNA

    取0.5 g新鮮果肉擠干水分于液氮中速凍,研磨成粉,迅速置于盛有1 mL SDS緩沖液的離心管中,于65 ℃水浴30 min,不時顛倒混勻。在離心管加入0.4 mL 3 mol/L KAc溶液(pH 5.5),混勻,冰浴20 min,4 ℃、12 000×g離心20 min,取上清液。加入等體積氯仿-異戊醇溶液(24∶1,V/V),輕輕顛倒混勻,4 ℃、12 000×g離心15 min,取上清液。加入1/2體積的冰異丙醇溶液,輕輕顛倒混勻(見絲狀沉淀),于 -20 ℃沉淀30 min。4 ℃、12 000×g離心10 min,棄上清液。加入75%乙醇溶液洗滌2 次,室溫晾干,用適量DEPC水溶解并置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.5 Trizol法提取總RNA

    取0.5 g新鮮果肉擠干水分于液氮中速凍,研磨成粉,快速轉(zhuǎn)入盛有1 mL Trizol的離心管中,旋渦振蕩充分混勻。加入約1/5體積的氯仿,旋渦混勻約15 s,室溫靜置5 min,于4 ℃、12 000×g離心20 min。取上清液,加入等體積的異丙醇,輕輕顛倒混勻,室溫靜置5 min,于4 ℃、12 000×g離心10 min。去上清液,加入200 μL 75%乙醇溶液洗滌2 次,室溫晾干,用30 μL DEPC水溶解并置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.6總RNA檢測

    用Tris-硼酸電泳緩沖液(0.5×TBE)、1.0%瓊脂糖凝膠檢測RNA的純度及完整性。

    紫外分光光度計測定A230nm、A260nm、A280nm值,A260nm∶A280nm、A260nm∶A230nm比值檢測RNA純度。計算樣品總RNA提取量(μg/g)。

    1.3.7 RT-PCR分析

    參照馬六甲蒲桃β-actin部分序列(登錄號:ADB43594.1)和過氧化物酶(peroxidase,POD)(登錄號:ACJ11762.1),并委托上海英濰公司合成。其中β-actin上游引物FP:5'-CCATTCAGGCTGTCCTTTCC-3',下游引物RP:5'-AGCTTTTCCTTCATGTCCCT-3',POD上游引物FP:5'-AGATTCCGTTGTTGCTTTAGGTG-3',下游引物RP:5'-GGCATTGATGTTGTTCTCGTTG-3'。按照TIANScript RT Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再根據(jù)2×Taq PCR MasterMix說明在PCR反應(yīng)管中調(diào)試反應(yīng)液和設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳,余下反應(yīng)液于-70 ℃保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1總RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測

    圖1 5種不同的方法提取蓮霧果實總RNA的電泳圖Fig.1 Electrophoretograms of total RNA extracted from wax apple fruit by five methods

    圖1顯示,只有4 種方法可從蓮霧果實組織獲得一定量的總RNA,而不同提取方法獲得的RNA質(zhì)量又有明顯的差異。試劑盒法、CTAB法和改良CTAB法均能得到28S、18S和5S 3 條條帶,條帶清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象,且28S條帶的亮度約為18S的2 倍,說明提取的總RNA完整性較好,純度較高。SDS法雖獲得的RNA產(chǎn)量較多,但RNA有明顯降解,且出現(xiàn)明顯的DNA污染痕跡;而Trizol法提取的RNA無條帶出現(xiàn)。

    2.2總RNA樣品的純度和提取量

    表1 不同方法提取蓮霧果實總RNA的吸光度比值和提取量Table1 Yields and absorbance ratios of total RNA extracted from wax apple fruit by different methods

    對5 種方法提取的總RNA純度進(jìn)行分析,從表1可知,CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法的A260nm∶A280nm值均在1.8~2.1之間,A260nm∶A230nm值均在2.0~2.4之間,說明這3 種方法能有效去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖多酚和次生代謝物等雜質(zhì),所得RNA純度較高;SDS法雖然A260nm∶A280nm值均在1.8~2.0之間,但電泳檢測有DNA污染;而Trizol法的A260nm∶A280nm值低于1.8,A260nm∶A230nm值均低于0.9,說明含有較多的多糖等雜質(zhì)殘留。然而,從提取量來看,試劑盒法提取量最高,達(dá)到62.16 μg/g,且提取周期最短;改良CTAB法提取量也較高,可達(dá)36.09 μg/g;而CTAB法提取量則相對較低。

    2.3RT-PCR電泳結(jié)果分析

    圖2 總RNNAA的β-actin RT-PCR產(chǎn)物(A)和POD RT-PCR產(chǎn)物(BB)電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of RT-PCR products of total RNA extracted by five different methods

    將5 種方法提取的蓮霧果實RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈為模板做PCR擴(kuò)增。由圖2可知,CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法提取的蓮霧果實總RNA經(jīng)RT-PCR均得到與目的片段β-actin(245 bp)和POD(256 bp)大小一致的條帶,SDS法出現(xiàn)其他非目的條帶,而Trizol法也均未得到目的條帶,這說明CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法獲得的RNA質(zhì)量均能滿足后續(xù)分子實驗的需要。

    3 討 論

    RNA的提取是開展分子生物學(xué)研究中的一個最關(guān)鍵最基礎(chǔ)的問題,獲得完整的高純度RNA是基因克隆和表達(dá)等研究的關(guān)鍵所在。然而,不同的RNA提取方法各有其優(yōu)缺點,故需根據(jù)物種特性來選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。蓮霧果實富含多糖多酚、萜類物質(zhì)、色素、蛋白質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物[19],嚴(yán)重干擾其RNA的提取。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結(jié)合,導(dǎo)致RNA活性喪失[20],或形成不溶性復(fù)合物[21];而多糖會形成難溶的膠狀物,與RNA共沉淀下來[22];萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學(xué)降解和酶解[21]。

    本研究中SDS法的A260nm∶A280nm的低比率說明提取的RNA中有酚類和多糖類等物質(zhì)的殘留污染;且其5S條帶很亮,可能是萜類化合物和RNase的殘留,從而造成RNA的化學(xué)降解和酶解,同時其又未將RNA與DNA完全分離開來,使產(chǎn)物有明顯DNA雜帶污染;Trizol是目前較常用的一種提取RNA的試劑,操作簡便,省時省力。目前此法已成功的從一些植物果實[23-24]中分離出高質(zhì)量的RNA,但本實驗組發(fā)現(xiàn)此方法并不適于提取蓮霧果實RNA,其產(chǎn)物中有較多多糖等雜質(zhì)殘留,RNA質(zhì)量較差。Plant RNA Kit試劑盒,是一種適于提取富含多糖、多酚的植物材料總RNA的試劑盒,成功獲得了高產(chǎn)量高質(zhì)量蓮霧果實總RNA,且實驗周期短,效率高,但同時成本也較高。CTAB法通過在裂解細(xì)胞階段加入蛋白酶K排除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的干擾,而后又結(jié)合使用特異性沉淀RNA的LiCl,加上高濃度的Na+存在,有效清除了多糖和DNA的污染,獲得高質(zhì)量RNA且成本相對較低;而其缺點是周期較長,耗時耗力,且提取量較低。此法在香蕉[11]、枇杷[13-14]、越橘[15-16]、神秘果[25]等RNA提取的研究中也得到一致的結(jié)果。針對CTAB法濃度低提取量低的問題,改良CTAB法通過在第一步取樣時就先將新鮮樣品擠干,快速減少了樣品中糖類、色素等物質(zhì)含量,再結(jié)合75%乙醇溶液的預(yù)處理,獲得了高質(zhì)量總RNA的同時,其所得產(chǎn)量較未改良之前高出許多,而較試劑盒法其成本又低不少。

    CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法均能提取高質(zhì)量的蓮霧果實總RNA,滿足RT-PCR等以RNA為基礎(chǔ)的后續(xù)分子生物學(xué)研究,其中試劑盒法和改良CTAB法所得提取量較高??梢愿鶕?jù)實驗?zāi)康暮蛯NA質(zhì)量要求來選擇最佳提取方法。

    [1] AINSWORTH C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel)[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(3):198-203.

    [2] WANG C S, VODKIN L O. Extraction of RNA from tissues containing high levels of procyanidins that bind RNA[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(2): 132-145.

    [3] WILKINS T A, SMART L B. A laboratory guide to RNA: isolation,analysis and synthesis[J]. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 1997, 29(3): 34-38.

    [4] WAN C Y, WILKINS T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.)[J]. Analytical Biochemistry, 1994, 223(1): 7-12.

    [5] HU C G, HONDA C, KITA M, et al. A simple protocol for RNA isolation from fruit trees containing high levels of polysaccharides and polyphenol compounds[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2002,20(1): 69.

    [6] MOSTER C, GATTO P, MOSER M, et al. Isolation of functional RNA from small amounts of different grape and apple tissues[J]. Molecular Biotechnology, 2004, 26(2): 95-99.

    [7] CHOMCZYSKI P, SACCHI N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 162(1): 156-159.

    [8] 李紅熙, 徐美隆, 楊智. 一種適合葡萄多種組織的總RNA提取方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2012, 28(7): 155-159.

    [9] 張彥蘋, 王晨, 于華平, 等. 適于葡萄不同組織RNA提取方法的篩選[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 19(11): 135-140.

    [10] 姚玉新, 趙玲玲, 翟衡, 等. 改良熱硼酸法高效提取蘋果果實RNA[J].果樹學(xué)報, 2005, 22(6): 737-740.

    [11] ASIF M H, DHAWAN P, NATH P. A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2000, 18(2): 109-119.

    [12] GEHRIG H H, WINTER K, CUSHMAN J, et al. An improved RNA isolation method for succulent plant species rich in polyphenols and polysaccharides[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2000, 18(4):369-376.

    [13] 張玲, 林順權(quán), 楊向暉. 枇杷果實總RNA的提取及八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)片段的克?。跩]. 果樹學(xué)報, 2012, 29(4): 577-582.

    [14] JAIME M C, SUSANA S M, ASCENSION M M. RNA isolation from loquat and other recalcitrant woody plants with high quality and yield[J]. Analytical Biochemistry, 2014, 452: 46-53.

    [15] 裴嘉博, 李曉艷, 張亞東. 越橘果實總RNA 提取方法的比較研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 43(10): 30-34.

    [16] AAKOLA L, PIRTTILA A, HALONEN M, et al. Isolation of high quality RNA from Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Fruit[J]. Molecular Biotechology, 2001, 19(2): 201-203.

    [17] 邵毅, 羅云波, 張京聲, 等. 李果實高質(zhì)量RNA提取方法的比較和優(yōu)化[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 32(1): 57-62.

    [18] 馬敬, 紀(jì)鴻飛, 李培. 番茄果實RNA提取方法比較[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(3): 16-19.

    [19] 王曉紅. 蓮霧的營養(yǎng)成分分析[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2006(4): 53.

    [20] SCHNEITOBAUER A, SANDEMANN H J, ERMST D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Analytical Biochemistry, 1991, 197(1): 91-95.

    [21] GRAHAM G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1993,11(1): 32-37.

    [22] LEWINSOHN E, STEELE C L, CROTEAU R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(1): 20-25.

    [23] LIN Ying, CHEN Xiaojing. Comparison of methods for RNA extraction from papaya fruit[J]. Subtropical Agriculture Research,2008, 4(3): 229-232.

    [24] SABZEVARI A G, HOSSEINI R. A quick, efficient, and cost-effective method for isolating high-quality total RNA from tomato fruits,suitable for molecular biology studies[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2014, 44(4): 418-431.

    [25] 譚才鄧, 李靜, 鄧毛程. 神秘果果實總RNA提取方法的比較研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2013, 32(3): 409-412.

    Comparison of Extraction Methods for High Quality RNA from Wax Apple (Syzygium samarangense Merr. et Perry)

    YIN Zhenzhen1, WU Guangbin1, CHEN Fahe1,*, XIE Chaotian2
    (1. Food and Bio-engineering College, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

    The objective of the study was to extract high quality RNA from wax apple (Syzygium samarangense Merr. et Perry) fruits. The effectiveness of five RNA extraction methods, i.e., Plant RNA Kit, hexadecyltrimethylammonium bromide(CTAB), modified CTAB, sodium dodecyl sulfate (SDS) and Trizol, was evaluated. The results showed that the quality of total RNA extracted by SDS method was poor due to serious RNA degradation and genomic DNA contamination. The total RNA extracted with Trizol reagent contained various residues such as proteins and polysaccharides and exhibited no RNA bands. Plant Kit protocol, CTAB and modified CTAB methods were found to be suitable for total RNA extraction from wax apple fruit. RT-PCR analysis demonstrated that the RNA bands were consistent with the target fragment size, which showed that the extracted total RNA could be applied to subsequent molecular biology research.

    wax apple fruit; RNA isolation; polysaccharide; polyphenol; method

    S667.9

    A

    1002-6630(2015)14-0001-04

    10.7506/spkx1002-6630-201514001

    2014-11-19

    國家自然科學(xué)基金面上項目(31171777);福建省自然科學(xué)基金項目(2010J01211)

    尹珍珍(1989—),女,碩士研究生,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮。E-mail:837949196@qq.com

    陳發(fā)河(1960—),男,教授,碩士,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮。E-mail:fhchen@jmu.edu.cn

    猜你喜歡
    蓮霧清液條帶
    清液回配對酒精發(fā)酵的影響研究
    釀酒科技(2023年10期)2023-11-23 11:09:42
    豆清液不同超濾組分體外抗氧化活性研究
    建筑施工廢棄泥漿環(huán)保型分離技術(shù)的研究與探討
    名城繪(2019年4期)2019-10-21 05:09:13
    林邊蓮霧
    林邊蓮霧
    小品文選刊(2018年7期)2018-07-05 16:38:14
    林邊蓮霧
    意林(2018年10期)2018-05-09 11:42:18
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    乳酸菌及其相應(yīng)的上清液對凡納濱對蝦存活率、生長性能、免疫反應(yīng)和抗病性的影響
    飼料博覽(2015年12期)2015-04-04 04:28:36
    蓮霧圣女果低脂冰激凌的生產(chǎn)工藝研究
    亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩制服骚丝袜av| 天美传媒精品一区二区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品福利观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 听说在线观看完整版免费高清| 97热精品久久久久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜福利高清视频| 日韩三级伦理在线观看| 成人无遮挡网站| 如何舔出高潮| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲精品成人久久久久久| 精品久久国产蜜桃| 在线观看午夜福利视频| 精品日产1卡2卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 我的老师免费观看完整版| 午夜a级毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品不卡国产一区二区三区| 国产高清激情床上av| 成人漫画全彩无遮挡| 久久九九热精品免费| 极品教师在线视频| 国产精品99久久久久久久久| av中文乱码字幕在线| 变态另类丝袜制服| 毛片一级片免费看久久久久| 老司机福利观看| av专区在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本精品一区二区三区蜜桃| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中出人妻视频一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一级a爱片免费观看的视频| 国内精品久久久久精免费| 白带黄色成豆腐渣| 国产真实伦视频高清在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 精品久久久久久久末码| 午夜福利成人在线免费观看| 国内精品一区二区在线观看| www日本黄色视频网| a级毛片a级免费在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久精品国产自在天天线| 我要看日韩黄色一级片| 久久久国产成人免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97超碰精品成人国产| 国产成人精品久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品一区二区性色av| 十八禁网站免费在线| 国产亚洲精品久久久com| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美区成人在线视频| 99热网站在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 青春草视频在线免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 美女 人体艺术 gogo| 看片在线看免费视频| 国产爱豆传媒在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 偷拍熟女少妇极品色| 国产日本99.免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲美女视频黄频| 一本一本综合久久| 99久久精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久大精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 人妻制服诱惑在线中文字幕| avwww免费| 精品久久久久久久末码| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩欧美精品v在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 深夜a级毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 成人无遮挡网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美潮喷喷水| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 最好的美女福利视频网| 十八禁网站免费在线| 久久九九热精品免费| 亚洲不卡免费看| 成人永久免费在线观看视频| 一区二区三区高清视频在线| 十八禁网站免费在线| 夜夜爽天天搞| 99热全是精品| 国产精品野战在线观看| 免费看光身美女| 国产精品无大码| 中国国产av一级| 一进一出抽搐动态| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 九色成人免费人妻av| 日韩亚洲欧美综合| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品乱码一区二三区的特点| 91av网一区二区| 岛国在线免费视频观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 色在线成人网| 波多野结衣高清作品| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费黄网站久久成人精品| 在线国产一区二区在线| 国产免费一级a男人的天堂| 深夜精品福利| 99久国产av精品国产电影| 丝袜喷水一区| 全区人妻精品视频| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲七黄色美女视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色av中文字幕| 日韩精品中文字幕看吧| 2021天堂中文幕一二区在线观| 露出奶头的视频| 国产人妻一区二区三区在| 精品久久久久久久久久免费视频| 在线a可以看的网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 超碰av人人做人人爽久久| 韩国av在线不卡| 久久久久久久久中文| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 91在线观看av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产91av在线免费观看| 国产探花极品一区二区| 97碰自拍视频| 亚洲18禁久久av| 日韩高清综合在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 黄色配什么色好看| 色在线成人网| 日韩欧美免费精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 色综合色国产| 露出奶头的视频| 欧美高清性xxxxhd video| 国产午夜福利久久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 级片在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 中国美女看黄片| 日韩一区二区视频免费看| 美女大奶头视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲精品av在线| 久久久成人免费电影| 久99久视频精品免费| 伊人久久精品亚洲午夜| 97在线视频观看| 校园春色视频在线观看| 97碰自拍视频| 嫩草影院入口| 国产精品亚洲美女久久久| 久久中文看片网| 国产日本99.免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 午夜a级毛片| 午夜精品在线福利| 国产探花在线观看一区二区| 在线国产一区二区在线| 伦精品一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 亚洲最大成人av| 久99久视频精品免费| 免费观看精品视频网站| 国产老妇女一区| 国产一区二区在线观看日韩| 免费看美女性在线毛片视频| 国产69精品久久久久777片| 日韩一区二区视频免费看| 欧美日韩精品成人综合77777| 老司机影院成人| 国产探花极品一区二区| 少妇的逼好多水| 成熟少妇高潮喷水视频| 22中文网久久字幕| 日韩高清综合在线| 亚洲国产精品合色在线| 听说在线观看完整版免费高清| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲美女黄片视频| 亚洲人与动物交配视频| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 简卡轻食公司| 婷婷亚洲欧美| 日韩欧美精品v在线| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲不卡免费看| 女同久久另类99精品国产91| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人无遮挡网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 97超视频在线观看视频| 高清毛片免费看| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲av熟女| 看片在线看免费视频| 日韩制服骚丝袜av| 色av中文字幕| 国产 一区精品| 午夜爱爱视频在线播放| 免费观看在线日韩| videossex国产| 免费一级毛片在线播放高清视频| av在线观看视频网站免费| 日本免费a在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久人人精品亚洲av| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲不卡免费看| 成人特级黄色片久久久久久久| 十八禁网站免费在线| 成人二区视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本一二三区视频观看| 免费看光身美女| 久久精品综合一区二区三区| 国产探花在线观看一区二区| 日韩三级伦理在线观看| 一本精品99久久精品77| 亚洲美女视频黄频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美色视频一区免费| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久精品欧美日韩精品| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品久久久久久精品电影| 成人二区视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成人影院久久av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 九九热线精品视视频播放| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇丰满av| 国产亚洲欧美98| 国产精品一区二区性色av| 中国美女看黄片| 亚洲最大成人中文| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品亚洲美女久久久| 精品久久国产蜜桃| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 午夜福利18| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品亚洲美女久久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费观看精品视频网站| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成年免费大片在线观看| 国产三级在线视频| a级毛色黄片| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美色视频一区免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品久久视频播放| 网址你懂的国产日韩在线| 综合色丁香网| 色5月婷婷丁香| 成年女人永久免费观看视频| 国产色婷婷99| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久久久久久午夜电影| 日本三级黄在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久综合国产亚洲精品| 国产午夜精品论理片| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久久中文| 亚洲熟妇熟女久久| av专区在线播放| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品久久久噜噜| 我的女老师完整版在线观看| 老女人水多毛片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 美女大奶头视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 日韩一区二区视频免费看| 国产高清视频在线观看网站| 久久久精品大字幕| 五月玫瑰六月丁香| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 丰满的人妻完整版| 亚洲第一电影网av| 亚洲美女视频黄频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品一区二区三区av网在线观看| 亚州av有码| 久久人妻av系列| 丰满的人妻完整版| 国产色爽女视频免费观看| 日日撸夜夜添| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲综合色惰| 乱码一卡2卡4卡精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 精品久久久久久久末码| 精品不卡国产一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 国产视频一区二区在线看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 精品福利观看| 插阴视频在线观看视频| 不卡一级毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 国产高清视频在线播放一区| 最近的中文字幕免费完整| 国产爱豆传媒在线观看| 99热全是精品| 美女大奶头视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 级片在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产成人福利小说| 免费av观看视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲性久久影院| 我要搜黄色片| 少妇高潮的动态图| videossex国产| 国产视频一区二区在线看| 国产成人影院久久av| 全区人妻精品视频| av女优亚洲男人天堂| ponron亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 少妇丰满av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99热网站在线观看| 国产色婷婷99| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩成人伦理影院| 我要搜黄色片| 亚洲经典国产精华液单| 国产亚洲精品久久久com| 精品一区二区三区人妻视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 成人二区视频| 日韩制服骚丝袜av| 天堂网av新在线| 天堂√8在线中文| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久大精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品久久视频播放| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品一区www在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩精品青青久久久久久| a级毛色黄片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲自偷自拍三级| 午夜日韩欧美国产| 69人妻影院| 黄色日韩在线| 最近在线观看免费完整版| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 搡老岳熟女国产| 日本三级黄在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产色婷婷99| 听说在线观看完整版免费高清| 国产探花极品一区二区| 成人无遮挡网站| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜激情欧美在线| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲不卡免费看| 97超视频在线观看视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品野战在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 大香蕉久久网| 亚洲精品国产av成人精品 | 极品教师在线视频| 我的女老师完整版在线观看| 麻豆一二三区av精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成年版毛片免费区| 精品欧美国产一区二区三| 波多野结衣高清无吗| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品一区二区免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 深爱激情五月婷婷| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲四区av| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 91狼人影院| 日韩强制内射视频| 看十八女毛片水多多多| 一本一本综合久久| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲图色成人| 精品午夜福利在线看| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美三级亚洲精品| 少妇熟女欧美另类| 国产不卡一卡二| 国产乱人偷精品视频| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲性久久影院| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 又爽又黄无遮挡网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲人与动物交配视频| 欧美bdsm另类| 联通29元200g的流量卡| 午夜亚洲福利在线播放| av.在线天堂| 久久精品国产亚洲网站| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品电影一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 日本黄色视频三级网站网址| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 热99在线观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 岛国在线免费视频观看| 身体一侧抽搐| 国产精品一二三区在线看| av国产免费在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 哪里可以看免费的av片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精华一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲国产精品国产精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 女人被狂操c到高潮| av免费在线看不卡| 欧美高清成人免费视频www| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产av不卡久久| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜影院日韩av| 乱码一卡2卡4卡精品| 乱人视频在线观看| 在线观看66精品国产| 一进一出抽搐动态| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99热精品在线国产| 欧美在线一区亚洲| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲不卡免费看| a级毛片免费高清观看在线播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 高清毛片免费看| 丰满乱子伦码专区| 在线a可以看的网站| 免费在线观看成人毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 久久久色成人| 一级a爱片免费观看的视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩欧美 国产精品| 极品教师在线视频| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲最大成人中文| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美高清成人免费视频www| 性色avwww在线观看| av中文乱码字幕在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 嫩草影院精品99| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产亚洲精品久久久com| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲在线自拍视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品伦人一区二区| 亚洲内射少妇av| 三级经典国产精品| 在线看三级毛片| 亚洲av.av天堂| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久国产成人免费| 亚洲美女视频黄频| 中文资源天堂在线| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 午夜免费激情av| 精华霜和精华液先用哪个| 免费一级毛片在线播放高清视频| 97热精品久久久久久| 国产一区二区三区av在线 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲国产精品国产精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 12—13女人毛片做爰片一| 色尼玛亚洲综合影院| 免费看美女性在线毛片视频| 悠悠久久av| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美性感艳星| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品永久免费网站| 18禁在线播放成人免费| 日本黄大片高清| 国产久久久一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品不卡国产一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 色哟哟·www| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久草成人影院| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利成人在线免费观看| 激情 狠狠 欧美| 国内精品美女久久久久久|