ORP對釀酒酵母在木質(zhì)纖維素水解液抑制物中發(fā)酵的影響

郝學密，杜斌，劉黎陽，劉晨光，白鳳武

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ORP對釀酒酵母在木質(zhì)纖維素水解液抑制物中發(fā)酵的影響

郝學密，杜斌，劉黎陽，劉晨光，白鳳武

（大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連116024）

木質(zhì)纖維素水解液中的毒性副產(chǎn)物對釀酒細胞具有抑制作用，采用氧化還原電位(oxidoreduction potential, ORP)調(diào)控，能夠提高細胞對抑制物的耐受性。考察了代表性抑制物乙酸、糠醛及苯酚對酵母細胞生長和代謝的影響，并通過添加氧化劑赤血鹽(K3[Fe(CN)6])和還原劑二硫蘇糖醇(DTT)調(diào)節(jié)發(fā)酵液ORP初始值在（305±5）mV、（157±8）mV及（-150±5）mV，研究不同ORP條件下細胞對抑制物的耐受性影響。結(jié)果表明，氧化態(tài)能提高生物量并縮短發(fā)酵時間。除苯酚外，氧化態(tài)也利于提高乙醇的收率。對細胞保護劑甘油合成的方面，氧化態(tài)和還原態(tài)都會促進甘油合成。在水解液脫毒方面，氧化態(tài)表現(xiàn)比還原態(tài)要好，因為氧化態(tài)促進生物量積累，有利于通過細胞自身代謝脫毒。

木質(zhì)纖維素；抑制物；脅迫耐受性；氧化還原電位；脫毒

引 言

木質(zhì)纖維素是地球上產(chǎn)量最大的可再生生物質(zhì)資源，可用于生物燃料及生物基化學品的生產(chǎn)[1]。由于其組分纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互纏繞，具有極強的頑抗特性，因此對木質(zhì)纖維素物料的預處理就變得十分必要。在處理過程中一些毒性副產(chǎn)物生成，對后續(xù)發(fā)酵過程的菌體產(chǎn)生抑制作用，不利于生物轉(zhuǎn)化的進行。

抑制物的種類和含量受木質(zhì)纖維素來源和處理方式的影響，主要包括有機酸、呋喃衍生物和酚類物質(zhì)。有機酸主要為乙酸，來自于半纖維素乙?；慕到?，在水解液中濃度可達10 g·L-1[2]。其他有機酸如甲酸和乙酰丙酸則是由糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF）降解生成[3]。弱酸對細胞的抑制受其濃度影響，報道稱當脂肪酸濃度超過100 mmol·L-1對酵母產(chǎn)生抑制作用，低于此值時反而可提高乙醇得率[4-5]。呋喃類主要是糠醛（furfural）和5-HMF，分別由戊糖和己糖在酸性環(huán)境下脫水生成。稀酸預處理的玉米芯水解液中糠醛濃度可達到3.2 g·L-1[6]，而糠醛濃度達到2.88 g·L-1時，酵母對葡萄糖利用就會明顯延緩[7]。酚類化合物主要由木質(zhì)素降解形成。雖然濃度只有mg·L-1級別，但對細胞的抑制作用非常明顯[8]。

三類抑制物的作用機理各不相同。弱酸造成了胞內(nèi)環(huán)境的酸化，必須通過消耗ATP將多余的質(zhì)子泵出以維持胞內(nèi)的中性環(huán)境，影響了細胞正常的能量供給[9]?？啡┑纫种莆锬芤种瓢麅?nèi)的NAD(P)H的合成，或者加快其降解。而NAD(P)H/ NAD(P)+作為主要的輔因子，參與了細胞多個物質(zhì)代謝和能量代謝過程[10]。酚類物質(zhì)是強的蛋白變性劑，能夠改變細胞膜上蛋白活性及與脂肪的比例，因此影響酵母細胞的正常功能[11]。

一般而言，解決副產(chǎn)物毒性有如下方法：① 改善預處理條件降低副產(chǎn)物的生成[12]；② 使用脫毒技術去除毒性副產(chǎn)物[13]；③ 通過篩選和基因工程等方法得到具有抑制物抗性的微生物[14-15]；④通過過程工程的手段提高細胞的抗性[16]。

氧化還原電位（oxidoreduction potential, ORP）調(diào)控能夠從多個層面影響細胞的生理狀態(tài)，從而提高酵母對高濃度乙醇發(fā)酵的脅迫耐受性[17]。同時通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)：ORP變化與HSP家族等多種環(huán)境脅迫響應通路表達有關[10]。因此，ORP調(diào)控是否也能提高細胞對木質(zhì)纖維素水解液中抑制物的耐受性，是本文將要關注的重點。

1 材料和方法

1.1 菌株和發(fā)酵

菌種：ATCC 4126。

種子培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖30，酵母浸粉4，蛋白胨3。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：葡糖糖100，酵母浸粉4，蛋白胨3。

菌種預培養(yǎng)：從斜面上接一環(huán)菌體于含有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中，置于恒溫搖床上，在30℃和150 r·min-1條件下培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的種子培養(yǎng)液按10%接種于含100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中，起始接種菌種密度為OD620=0.25，置于恒溫搖床上，在30℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中，未添加任何試劑的搖瓶培養(yǎng)24 h，每隔4～5 h取樣2 ml分別存于1.5 ml離心管中，1 ml用于測OD620，1 ml用于測發(fā)酵產(chǎn)物組分。添加抑制物的試劑搖瓶培養(yǎng)60 h，每隔12 h取樣一次。

1.2 ORP調(diào)控方式

使用pH計（Sartorius PB-10，Mettler Toledo，Switzerland）連接ORP電極（Pt4805-DPAS- SC-K8S/225，Mettler Toledo，Switzerland），將電極經(jīng)酒精擦拭后插于發(fā)酵液中即可采集數(shù)據(jù)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加氧化劑（oxidant，O）赤血鹽（K3[Fe(CN)6]）16.9 g·L-1，還原劑(reductant，R)二硫蘇糖醇（DTT）0.5 g·L-1調(diào)節(jié)初始ORP值分別為(305±5) mV和(-150±5) mV。不加氧化還原劑的為空白對照組（control，C），ORP值為(157±8) mV。

1.3 組分分析

生物量測定：使用酶標儀（Thermo labsystems Multiskan Ascent 354）測發(fā)酵液OD620值。

發(fā)酵液組分：發(fā)酵液經(jīng)0.45mm親水性微孔濾膜過濾后，使用高效液相色譜（Waters 410，Waters，MA，USA）分析發(fā)酵液中乙醇、葡萄糖、甘油、乙酸和糠醛的量。色譜柱為有機酸分析柱（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，Hercules，Aminex HPX-87H），進樣量20ml，流動相為0.01 mmol·L-1硫酸溶液，流速為0.4 ml·min-1，示差檢測器溫度50℃，柱溫50℃。

苯酚含量測定：使用氣相色譜法進行分析。進樣口溫度250℃，柱溫200℃，檢測器溫度為250℃，檢測器為FID，色譜柱為毛細管玻璃柱Agilent HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.50mm），氫氣流速40 ml·min-1，空氣流速400 ml·min-1，載氣氮氣流速30 ml·min-1，進樣量0.1ml，分流50:1，內(nèi)標為苯甲醇。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制物添加對細胞生長和發(fā)酵的影響

木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物有機酸、糠醛類和酚類物質(zhì)對酵母生長抑制作用體現(xiàn)在最大生物量降低和達到最大生物量的時間延長。如圖1所示，相對于沒有抑制物添加的發(fā)酵過程，乙酸、糠醛和苯酚的添加使得生物量有明顯降低。其中5 g·L-1乙酸，2 g·L-1苯酚添加后細胞幾乎停止生長。4 g·L-1糠醛OD值仍能達到3.84左右，說明酵母細胞自身對糠醛的耐受性較好[18]。此外，無抑制物添加的生物量達到最大值只需20 h，而添加乙酸后需48～60 h，苯酚和糠醛需24～36 h，抑制物的添加顯著降低了細胞的生長速率。

由圖1(d)可知，抑制物濃度增加會降低細胞對葡萄糖的利用速度。在60 h的發(fā)酵時長內(nèi)，5 g·L-1的乙酸，2 g·L-1及以上的苯酚都沒有利用完葡萄糖，乙醇濃度也相應減少。但是乙酸和糠醛對細胞的影響主要是生物量上，對乙醇的收率影響較小。而苯酚的添加不僅改變了細胞的活性，還降低了乙醇的收率，改變了代謝通路的流量。

2.2 ORP對含乙酸體系細胞生長和發(fā)酵的影響

在3種乙酸添加濃度下，氧化態(tài)的發(fā)酵過程生物量有明顯的提高，與對照組相比提高了11%～26%。還原態(tài)的細胞生長表現(xiàn)最差，生物量與對照組相比下降了10%～53%。5 g·L-1乙酸添加后生物量積累最少，即使在最優(yōu)氧化態(tài)下，其生物量僅為0.73 g·L-1。因此，乙酸添加不超過4 g·L-1時葡萄糖在60 h內(nèi)基本上都已經(jīng)利用完畢，而當乙酸添加量為5 g·L-1時仍有53～83 g·L-1葡萄糖尚未使用。

由表1可知，在3 g·L-1的乙酸添加下，乙醇收率幾乎沒有改變。隨著乙酸濃度的提高，4 g·L-1氧化態(tài)的乙醇得率得到提高，比空白提高了8.8%。ORP的改變使甘油收率均有所增加，這是細胞應對外界環(huán)境變化的行為，因為甘油是細胞內(nèi)主要的保護物質(zhì)[19]。對于乙酸添加不超過4 g·L-1的情況，還原態(tài)的甘油收率最高，比對照組提高了50%～57%，因為甘油生成需要NADH所提供的還原力，還原態(tài)的發(fā)酵環(huán)境利于提高NADH的含量。而5 g·L-1的乙酸添加后由于抑制太過強烈，60 h細胞尚未進入對數(shù)生長期，葡萄糖幾乎未被利用，因此乙醇和甘油合成均不符合上述的規(guī)律。

表1 ORP調(diào)節(jié)下的乙酸對細胞生長和發(fā)酵的影響Table 1 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under acetic acid

2.3 ORP對含糠醛體系細胞生長和發(fā)酵的影響

糠醛影響酵母內(nèi)部的氧化還原平衡。由表2可見，與乙酸添加相類似，糠醛抑制下的生物量在氧化態(tài)情況下出現(xiàn)了最高，而在還原態(tài)下減小。比沒有氧化還原劑添加的對照組分別提高10%～21%和下降21%～45%。在此濃度下，糠醛對細胞的抑制效果較小，生物量均維持在較高水平，因此60 h內(nèi)的葡萄糖都消耗完畢，而乙醇的收率變化不明顯。

表2 ORP調(diào)節(jié)下的糠醛對細胞生長和發(fā)酵的影響Table 2 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under furfural

Note: Glucose residue were 0 for all experiments after 60 h.

乙醇的收率在氧化態(tài)下較高，而還原態(tài)與空白對照的收率相近。隨著糠醛的加入量增多，甘油的合成量在下降。這是由于糠醛會消耗細胞內(nèi)的還原力，競爭性地抑制甘油的合成[20]。在相同糠醛抑制物的環(huán)境下，氧化態(tài)和還原態(tài)的環(huán)境都會使甘油的合成量增加，但有趣的是，氧化態(tài)的甘油合成得略多一些?？赡芘c氧化態(tài)利于糠醛去除有關[21]。

2.4 ORP對含苯酚體系細胞生長和發(fā)酵的影響

在木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的多種抑制物中，酚類化合物對發(fā)酵的抑制作用最強，并且低分子量酚類化合物毒性最強[6]。如表3所示，苯酚的添加量從1 g·L-1增加到2 g·L-1后，細胞生長能力驟降，OD620由3.3左右降至0.55左右。在同一苯酚濃度下，氧化態(tài)的生物量最高，相比于空白對照提高了5%～10%，而還原態(tài)的生物量與對照組相比較相近或下降。2 g·L-1以上生物量就已出現(xiàn)了明顯的下降，因此葡萄糖在60 h內(nèi)并未完全用完。

表3 ORP調(diào)節(jié)下的苯酚對細胞生長和發(fā)酵的影響Table 3 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under phenol

苯酚濃度升高導致乙醇收率下降，而ORP調(diào)控對乙醇收率無顯著影響。在添加1 g·L-1苯酚的情況下，氧化劑和還原劑的添加均有利于甘油合成，相比于空白對照組提高了10%～20%。而當苯酚濃度提高后（≥2 g·L-1），由于細胞長時間處于停滯期，造成甘油收率并不存在明顯規(guī)律。氧化還原劑可以通過直接的化學反應去除苯酚分子[16,22]。

2.5 ORP調(diào)控下細胞對抑制物的脫毒作用

通過酵母自身代謝，ORP調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程的原位脫毒。乙酸為乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物，發(fā)酵后會少量產(chǎn)生，如果發(fā)酵初期加入乙酸，反而會被細胞吸收脫除。如圖2（a）所示，細胞在氧化態(tài)和還原態(tài)下對乙酸的利用較好，脫毒率分別為0.167～0.304（氧化態(tài)）和0.105～0.173（還原態(tài)），尤其是在添加乙酸濃度較低時效果更佳。而細胞在空白狀態(tài)下脫去乙酸能力最差，仍可觀察到乙酸濃度的積累（脫毒率為負值）。這與生物量關系符合較好，氧化態(tài)生物量高，乙酸脫毒率高；還原態(tài)生物量低，乙酸脫毒率低。

釀酒酵母可以將酚類轉(zhuǎn)化為毒性較小的醇類物[23]，而氧化還原劑的添加有利于進一步幫助細胞去除酚類。如圖2（b）所示，加入氧化還原試劑的發(fā)酵比空白對照組的脫毒效果好，這與已報道的脫毒結(jié)果相一致[16]。值得注意的是，1 g·L-1苯酚添加后，氧化態(tài)脫毒能力比還原態(tài)高60%，脫毒率接近100%。氧化還原劑直接發(fā)生反應所去除的苯酚量較少，因為可以明顯看到[圖2（b）]，相同氧化還原劑添加，對苯酚的去除率卻有極大的差異，這反映出在苯酚去除的過程中，細胞生物量和活性才是決定脫毒效果的關鍵，對比表3生物量的數(shù)據(jù)，同樣存在有生物量大，脫毒率大的關系。

細胞對糠醛的脫毒效果最好，在規(guī)定發(fā)酵時間內(nèi)其脫毒率皆為100%，糠醛被轉(zhuǎn)化為糠醛醇[7]。但不同ORP條件下脫毒率到達100%的時刻卻有所不同，分別為48 h（C）、24 h（O）和24 h（R）。NADH及依賴于NADH的氧化還原酶能夠幫助去除糠醛[24-25]，而調(diào)節(jié)ORP可以調(diào)控胞內(nèi)NADH/ NAD+的比值，賦予細胞很好的糠醛脫毒能力。

3 結(jié) 論

本文通過添加氧化劑赤血鹽和還原劑DTT調(diào)控發(fā)酵體系ORP，考察了酵母細胞在3種典型木質(zhì)纖維素水解液抑制物乙酸、糠醛及苯酚中的發(fā)酵性能。得到如下結(jié)論。

（1）抑制物的添加降低了生物量，進一步使葡萄糖利用和終點乙醇濃度降低，但是糠醛和乙酸不會影響代謝分布，而苯酚使得乙醇收率降低。

（2）在抑制物存在的情況下，氧化態(tài)可以提升生物量，進而改善發(fā)酵結(jié)果。除苯酚外，氧化態(tài)的環(huán)境有利于提高乙醇收率。在添加氧化還原劑后甘油合成得到了促進。對于乙酸濃度超過5 g·L-1，苯酚濃度大于2 g·L-1的情況，由于細胞幾乎沒有生長，因此ORP調(diào)控并沒有明顯的規(guī)律性。

（3）進行ORP調(diào)控有利于脫除抑制物。氧化還原劑的加入會直接與抑制物發(fā)生化學作用，但更多的是促進酵母細胞通過自身代謝去除抑制物。

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Effect of ORP regulation on yeast fermentation with inhibitors of lignocellulose hydrolysate

HAO Xuemi, DU Bin, LIU Liyang, LIU Chenguang,BAIFengwu

School of Life Science and BiotechnologyDalian University of TechnologyDalianLiaoningChina

A broad range of inhibitors in hydrolysate of lignocellulose, including weak acids, furan derivatives and phenolic compounds restrain yeast growth and subsequent fermentation. The effect of oxido-reduction potential (ORP) regulation on yeast cell tolerance to the presence of acetic acid, furfural and phenol was investigated. Cell growth and metabolite distribution changed under different ORP levels [(305±5) mV, (157±8) mV and (-150±5) mV] by feeding oxidant (potassium ferricyanide, K3[Fe(CN)6]) and reductant (dithiotreitol, DTT). Compared to the control group, cell growth was enhanced, and ethanol yield increased except for phenol group. The yield of glycerol was enhanced under both oxidizing and reducing conditions, since glycerol was a main protective molecule in yeast. High ORP level facilitated detoxification of inhibitors thanks to high biomass accumulation.

lignocellulose; inhibitors; stress tolerance; ORP; detoxification

2014-08-28.

LIU Chenguang, cg_liu@dlut.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141318

Q 815

A

0438—1157（2015）03—1066—06

國家自然科學基金項目（21406030）；中國博士后科學基金特別資助項目（2013T60286）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（DUT14QY19）；遼寧省博士科研啟動基金項目（20141027）。

2014-08-28收到初稿，2014-11-30收到修改稿。

聯(lián)系人：劉晨光。第一作者：郝學密（1989—），女，碩士研究生。

supported by the National Natural Science Foundation of China(21406030), the China Postdoctoral Science Special Foundation (2013T60286), the Fundamental Research Funds for Central Universities (DUT14QY19) and the Liaoning Province Doctor Startup Fund (20141027).