溫度脅迫對掌狀海帶幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)及葉綠素熒光的影響

凌晶宇 , 梁洲瑞, 王飛久, 孫修濤, 汪文俊, 劉福利, 姚海芹

(1. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071)

掌狀海帶(Laminaria digitata(Hudson)J.V.Lamouroux)[1]屬于褐藻門(Phaeophycophyta)、海帶目(Laminariales)、海帶科(Laminariaceae)、海帶屬(Laminaria)[2-4]。掌狀海帶分布于北大西洋沿岸, 主要包括格陵蘭島南部、冰島沿岸、愛爾蘭西北部、英國南海岸、法國西北部、挪威北海岸[5-8]。作為一種大型海藻, 掌狀海帶參與調節(jié)近岸海域生態(tài)環(huán)境[9-10],同時也具有重要的經濟價值, 國外大量使用掌狀海帶生產褐藻膠, 提煉碘, 且有多種礦物質、維生素,可作為食品添加劑, 用于家禽、家畜養(yǎng)殖飼料[11-14]。目前對于掌狀海帶的研究主要集中在生物活性物質的提取與研究[15-17]、生態(tài)資源調查[18-20]、繁殖生物學研究[21-23]、分子標記以及遺傳多樣性研究[24-26], 而對環(huán)境因子的生理響應研究較少[27-30]。

由于葉綠素熒光技術在測定植物光合作用具有不損傷植物組織、測定指標多樣化和指示更靈敏等優(yōu)點, 現(xiàn)已被廣泛應用于植物光合作用機理的研究[31-32]。植物進行光合作用所吸收的光能主要用于光化學反應, 僅有少部分能量以熱和熒光耗散掉,而脅迫條件會導致植物以熱和熒光耗散能量的增加,因此調制熒光技術可以評估植物受脅迫的情況[33]。目前對于大型海藻(如鼠尾藻、龍須菜、條斑紫菜等)理化因子脅迫機制的研究已有報道[34-37]。

不同植物都有其最適宜生長溫度, 溫度高于或低于各自最適宜生長溫度都有可能成為脅迫, 導致細胞膜結構遭到破壞, 抑制生長, 引起個體損傷甚至死亡[38]。研究認為高溫脅迫下植物體抗氧化防御系統(tǒng)能夠通過抑制由高溫產生的活性氧(ROS)的生成, 或緩解活性氧引起的損傷等途徑來緩解生物體內的氧化脅迫[39]。逆境脅迫將會導致活性氧在藻體內大量的積累, 從而干擾細胞內膜脂、核酸以及蛋白質的代謝, 且自由基作用于脂質, 發(fā)生過氧化反應并產生丙二醛, 引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合, 且具有細胞毒性[40]。SOD、CAT是植物清除體內多余 O2–和 H2O2等活性氧的重要酶類, 統(tǒng)稱為植物保護酶系統(tǒng), 對抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護膜結構完整等起著重要作用[41]。

本實驗選用掌狀海帶為材料, 研究了溫度脅迫對其幼苗生長及抗氧化系統(tǒng)的影響, 以期為完善掌狀海帶人工養(yǎng)殖技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用掌狀海帶幼苗(2～3 cm)由配子體克隆育苗培育而來, 培養(yǎng)條件: 白色日光燈, 光強2100～3500 lx, 溫度 13℃, 光周期 12L: 12D, 培養(yǎng)液為滅菌天然海水, 營養(yǎng)鹽以 NaNO3溶液作為氮源,KH2PO4作為磷源。NO3–-N 質量濃度 3 mg/L, PO4–-P質量濃度0.3 mg/L, 充氣懸浮培養(yǎng)。每周換水2次。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同溫度脅迫下掌狀海帶幼苗生長測定

設置 3 個溫度組(3、8、18℃)和對照組(13℃), 每組3個平行。培養(yǎng)條件為: 光照培養(yǎng)箱培養(yǎng), 光周期12L: 12D, 光強 3500 lx, NO3–-N 質量濃度 3 mg/L,PO4–-P質量濃度 0.3 mg/L。在不同條件處理下持續(xù)培養(yǎng)10 d, 3 d換水一次。實驗開始前挑選藻體完整、無損傷腐爛的掌狀海帶幼苗, 平均鮮質量為(0.020±0.003)g, 各處理組之間的鮮質量差異性不顯著(P＞0.05)。第5天和第10天后各稱量一次鮮質量, 計算相對生長速率(RGR, relative growth rate), 相對生長率的計算公式如下: RGR=[Ln(Wt/W0)/t]×100%,其中W0為初始藻的鮮質量(g),Wt為實驗結束時藻的鮮質量(g),t為實驗持續(xù)的時間(d)。

1.2.2 不同溫度脅迫下掌狀海帶幼苗抗氧化酶系測定

設置 3 個溫度組(3、8、18℃)和對照組(13℃), 每組3個平行, 分別于培養(yǎng)4、12、24、36、48 h后取樣測定。培養(yǎng)條件為: 光照培養(yǎng)箱培養(yǎng), 光周期12L:12D, 光強 3500 lx, NO3–-N 質量濃度 3 mg/L, PO4–-P質量濃度0.3 mg/L。稱取0.1g左右掌狀海帶幼苗材料, 用1.5 mL提取液(0.1 mol/L磷酸緩沖液 pH=7.0;1 mol/L EDTA; 1% PVP)在冰浴條件下研磨勻漿。4℃,10000 r/min離心10 min, 取上清液待測。可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(A045-2);超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001-1)、過氧化氫酶(catalase CAT)測定試劑盒(A007-1)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1)均購自南京建成公司。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 不同溫度脅迫下掌狀海帶幼苗葉綠素熒光參數(shù)測定

設置 3 個溫度組(3、8、18℃)和對照組(13℃), 每組9個平行, 分別于培養(yǎng)4、12、24、36、48 h后取樣測定。培養(yǎng)條件為: 光照培養(yǎng)箱培養(yǎng), 光周期12L:12D, 光強 50 μmol/(m2·s), NO3–-N 質量濃度 3mg/L,PO4–-P質量濃度0.3 mg/L。葉綠素熒光參數(shù)的測定均采用DUAL-PAM-100(WALZ, Germany)。幼苗進行暗適應20 min后再測Fv/Fm; 測定快速光曲線時,設置的光合有效輻射(PAR)分別為 59、79、123、181、281、352、553、777 μmol/(m2·s), 每個 PAR照射10 s。

1.3 數(shù)據分析

采用Origin繪制圖形, SPSS進行單因子方差分析、多重比較, 以P＜0.05作為差異顯著。數(shù)據用平均值±標準差(Mean±SD)形式表示。用Statistica7.0軟件, 采用最小二乘法對快速光曲線進行擬合[42], 以求出rETRmax(最大潛在相對電子傳遞速率)。

2 結果

2.1 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗生長的影響

溫度從 3℃升高到 18℃時, 掌狀海帶幼苗 RGR在5、10 d均呈先上升后下降趨勢, 在對照組(13℃)培養(yǎng)條件下時, 幼苗 RGR最大, 分別為 10.9%和11.0%(圖1)。經單因素方差分析表明, 對照組與其他實驗組的RGR相比均呈顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗相對生長速率的影響Fig.1 Effect of temperature stress on the relative growth rates of L.digitata sporophytes

2.2 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量的影響

處理4h后, 18℃組可溶性蛋白含量顯著高于13℃組(P＜0.05), 且達到最大值(圖2); 處理12 h后,3℃組可溶性蛋白含量較初始值上升 27.9%并達最大值; 處理24 h后, 13℃組可溶性蛋白含量較初始值上升 16.4%且達到最大值(P＜0.05), 18℃組值較初始值下降 5.8%, 達最小值(P＜0.05)。8℃組的可溶性蛋白隨著處理時間的推移呈現(xiàn)小幅度波動,24h后較初始值上升 19.1%, 達最大值且差異性不顯著。

圖2 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of temperature stress on thesoluble proteins contentof L.digitata sporophytes

隨著時間推移, 各實驗組的MDA值均呈先上升后下降的趨勢(圖3)。處理4 h, 各組MDA含量達最大值, 且 3、18℃組 MDA含量高于 8℃組和對照組(13℃), 18℃組差異性顯著(P＜0.05)。處理 24 h, 3、8℃組和對照組MDA含量達最小值, 與初始值對比, 分別下降19.9%、31.2%、32.6%, 而18℃組在處理12 h后出現(xiàn)最小值且下降了24.1%。在處理時間24～48 h內, 各溫度組MDA含量均上升, 且3、18℃組MDA含量高于8℃組和對照組。在48 h處理后, 各組MDA含量與初始值對比無差異性。

圖3 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of temperature stress on the malondialdehyde(MDA)content of L.digitata sporophytes

2.3 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗酶促抗氧化系統(tǒng)活性的影響

處理時間36 h內, 18℃組和對照組(13℃)CAT活性呈先上升后下降趨勢(圖4), 均在24 h處達最大值,且對照組差異性顯著(P＜0.05), 在 36 h處 18℃組CAT活性達最小值; 3℃和8℃組CAT活性先下降后上升, 均在12、36 h處達極值。在36～48 h內, 各組CAT活性均隨時間推移而下降, 且與初始值對比無差異性。

圖4 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature stress on the catalase (CAT)activity of L.digitata sporophytes

圖5 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗超氧化物歧化酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature stress on the superoxide dismutase (SOD)activity of L.digitata sporophytes

在處理時間24h內, 18℃組和對照組(13℃)SOD活性呈上升趨勢(圖5), 均在24h處達最大值且差異性顯著(P＜0.05), 與初始值對比, 增加量分別為64.2%、57.1%; 3℃和8℃組SOD活性在處理4 h后下降并隨著時間推移在24 h處達最大值。在24～48 h內, 各組 SOD活性出現(xiàn)不同程度下降, 18℃組在處理后36 h達最小值。

2.4 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗葉綠素熒光各參數(shù)的影響

3℃組處理 4 h后的Fv/Fm值顯著低于對照組(P＜0.05), 為對照組的89.1 % (圖6)。8℃組處理24 h后的Fv/Fm值達最大, 為0.76; 處理36 h,Fv/Fm值顯著低于對照組(P＜0.05), 為對照組的91 %。18℃組的Fv/Fm值隨著處理時間延長而下降, 在 36 h和 48 h處達顯著程度(P＜0.05)。

圖6 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗Fv/Fm的影響Fig.6 Effect of temperature stress on the optimal chlorophyll fluorescence quantum yields (Fv/Fm)of L.digitata sporophytes

圖7 溫度脅迫對掌狀海帶幼苗rETRmax的影響Fig.7 Effect of temperature stress on the maximum relative electron transport rate (rETRmax)of L.digitata sporophytes

3℃組處理 4 h后的 rETRmax值顯著低于對照組(13℃,P＜0.05), 為對照組的 86.2 %(圖 7)。18℃組處理12 h后的rETRmax值與對照組間差異顯著(P＜0.05)。8℃組的 rETRmax值呈先上升后下降的趨勢, 在 24 h處達最大值, 且與對照組間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

Bolton在其實驗中發(fā)現(xiàn)掌狀海帶幼苗在 10～15℃具有較高的生長速率[43], 隨著溫度升高RGR逐漸降低, 在 23℃時, 幼苗幾乎完全分解。本試驗中,掌狀海帶幼苗在13℃具有最高的RGR, 18℃條件下幼苗培養(yǎng)10 d后的相對生長速率明顯低于5d所測,下降21.5%。有研究表明, 隨著溫度升高, 植物葉綠體結構受到損傷, 光合色素降解, 導致凈光合速率下降, 物質積累率下降[44]。Havaux發(fā)現(xiàn)高溫脅迫對PSII中心有瞬時鈍化作用, 使富含不飽和脂肪酸的類囊體膜脂降解, 進一步降低光合反應速率[45]。因此高溫條件下, 掌狀海帶幼苗的生長勢必會受到影響。

植物體內的抗氧化防御系統(tǒng)是一個立體的結構,其所含許多的成分在植物抗逆性中具有重要作用。在酶促抗氧化系統(tǒng)中, 包括CAT、SOD等抗氧化酶,SOD是主要的活性氧(ROS)清除酶類; CAT可以保護細胞免受羥過氧化物的脅迫, 使H2O2歧化產生H2O和 O2, 當細胞產生脅迫的適應反應時, CAT對于細胞獲得抗性十分重要[46], 它們在保護細胞免受氧化脅迫方面具有重要意義。關于高溫對植物機體的影響, 有證據表明, 植物受高溫脅迫引起葉綠素分解、可溶性蛋白含量下降、膜透性加大等, 可能是機體內O2–等活性氧產生和清除平衡遭到破壞的結果, 高溫可從促進 O2–等活性氧形成、鈍化 SOD等抗氧化酶活性兩方面破壞這種平衡[47-48]。實驗中, 處理 24 h后, 掌狀海帶幼苗的CAT、SOD在13、18℃保持著較高的活性, 而低溫組3、8℃酶活性則相對較低, 表現(xiàn)在掌狀海帶幼苗生長為具有較低的 RGR。高質量濃度的 ROS可引起蛋白質肽鏈斷裂和交聯(lián), 導致蛋白質分子中堿性氨基酸含量降低, 而高的保護酶活性能有效清除過量積累的 ROS, 使植物免受活性氧的毒性作用, 這對于植物的抗逆性具有重要意義。ROS學說在高等植物中研究比較多[49-50], 在低等藻類植物中相關研究比較少。植物的總抗氧化能力是由酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)兩部分的抗氧化能力共同組成, 而對于掌狀海帶非酶促抗氧化系統(tǒng)在逆境中對 ROS、羥過氧化物等有害物質的清除作用有待進一步研究。

葉綠素熒光技術能夠實時準確地反映植物自身光合特性以及環(huán)境適應能力[51]。在正常的生理狀態(tài)下, 暗適應20 min后所測出PSII的Fv/Fm是一個穩(wěn)定的值, 藻類約為0.65, 當受到脅迫時, 該值顯著下降。相對電子傳遞速率(rETR)是快速光曲線測定過程中反映實際光強下的表觀電子傳遞速率[32,52]。本實驗中, 3℃處理下, 掌狀海帶幼苗的Fv/Fm值明顯下降,rETRmax值在處理 4h后達最小, 同時其 CAT、SOD酶活性均處于較低水平, MDA含量較高, 說明低溫可能使掌狀海帶幼苗光合能力和光合活性下降。研究表明, 光合色素和電子傳遞鏈是植物細胞類囊體膜的重要組成部分, 高溫可導致其結構改變, 勢必會影響光合作用[53]。本次實驗中, 18℃組的掌狀海帶幼苗Fv/Fm、rETRmax值整體呈下降趨勢, 且該條件下抗氧化酶活性波動較大, 表明該條件下掌狀海帶幼苗光合電子傳遞過程受抑制。有研究指出, 溫度高于32℃時鼠尾藻幼苗會受到光抑制和損傷; 銅藻幼苗在30℃高溫脅迫下也對其PSII造成不可逆損傷[34,54]。

可溶性蛋白在抵御溫度逆境脅迫過程中起重要作用。研究表明, 細菌、植物及動物體在受到高溫脅迫時其機體內熱激蛋白含量均會升高, 從而抵御高溫脅迫[50]。本實驗脅迫初期掌狀海帶可溶性蛋白含量明顯升高, 可能是幼苗對溫度變化做出的積極反應, 使其體內產生了一些熱激蛋白; 隨著脅迫時間的延長, 18℃組在24 h含量顯著降低, 可能是海帶防御體系遭到破壞, 細胞膜結構受損, 蛋白質合成受到抑制而分解加速導致可溶性蛋白含量降低。細胞膜系統(tǒng)是熱損傷和抗熱中心, 細胞膜的熱穩(wěn)定性與脂肪酸飽和程度有關, 高度飽和的脂肪酸有利于提高細胞膜的相變溫度, 而高溫會加劇膜脂過氧化作用[38]。丙二醛(MDA)是脂類過氧化物之一, 是指示植物體膜過氧化程度的一個重要指標。從本實驗結果來看, 處理4h各組MDA含量均有所上升, 隨著處理時間延長, 13、18℃組均在12 h處達最小值且顯著低于低溫組(3、8℃); 48 h后各組MDA含量較初始值相比無差異。實驗結果說明, 在合適的生長溫度下,掌狀海帶幼苗細胞內抗氧化酶活性較高, 使得 MDA含量保持在較低水平, 表現(xiàn)為具有較高生長速率。

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