SPE-HPLC法測(cè)定水中硝基苯酚類化合物

秦承華，王晶晶，張 軍，彭 華，王玲玲，南淑清，李紅亮，吳立業(yè)

1．中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

2．河南省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，河南 鄭州 450004

硝基苯酚類化合物多為黃色晶體，常被用作合成染料、醫(yī)藥、指示劑、橡膠助劑、感光材料等的中間體，有較強(qiáng)的毒性［1-2］。在國(guó)外的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)中，前蘇聯(lián)將飲用水中的硝基苯酚限值規(guī)定為0.06 mg/L(鄰、間硝基苯酚)和0.02 mg/L(對(duì)硝基苯酚);美國(guó)環(huán)保局(USEPA)在 2012年《Drinking Water Standards and Health Advisories》［3］中規(guī)定了飲用水中對(duì)硝基苯酚的終生安全飲用限值(LHA)0.06 mg/L，并且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，超過此安全限值，會(huì)對(duì)健康造成損害;USEPA還在《Ambient Water Quality Criteria for Nitrophenols》［4］中規(guī)定，二硝基苯酚類限值為68.6 μg/L，三硝基苯酚類限值為 10 μg/L，二硝基甲酚類的限值為12.8 μg/L。目前，在國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(如《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》、《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》)中，并沒有查到關(guān)于硝基苯酚類化合物限值的規(guī)定。因此，我國(guó)制定硝基苯酚在環(huán)境水體中的限值及開發(fā)迅速有效的硝基苯酚監(jiān)測(cè)分析方法很有必要。

固相萃取法(SPE)是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)。相比于傳統(tǒng)的液液萃取法，SPE大大減少了有機(jī)溶劑的使用量［5］，而且回收率高、處理時(shí)間短、重現(xiàn)性高［6］，同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)水中酚類物質(zhì)的高倍數(shù)富集［7］，是一種較為理想的前處理方式。

在涉及硝基酚類化合物的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)分析方法中，氣相色譜(質(zhì)譜)法［8-12］是最為常用的分析方法，但氣相色譜法適用于具有較好熱穩(wěn)定性和較好揮發(fā)性的目標(biāo)化合物。雖然利用衍生化法［13-15］可以降低氣相色譜法測(cè)定酚類化合物的檢出限，但衍生化法處理步驟比較繁瑣，還可能會(huì)損傷色譜柱。而高效液相色譜法適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的目標(biāo)化合物，不需要復(fù)雜的前處理步驟即可達(dá)到較高的靈敏度，所以高效液相色譜法更適合于硝基苯酚類化合物的檢測(cè)。本文以固相萃取為前處理?xiàng)l件，用液相色譜法測(cè)定水中10種硝基苯酚類化合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A液相色譜儀，帶有二極管陣列檢測(cè)器;Waters XbridgeTMPhenyl柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);Supelco固相萃取裝置;氮吹濃縮儀;垂直振蕩器;一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

Waters HLB(6 mL/150 mg)固相萃取柱;0.45 μm針頭式過濾器;玻璃棉(400℃加熱1 h);氯化鈉(105℃烘干2 h);氫氧化鈉;無水硫酸鈉(400℃烘干2 h);濃鹽酸(1.19 g/mL);甲酸(99.8%)、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈均為色譜純;氮?dú)?純度≥99.999%);干燥漏斗:內(nèi)徑為40 mm，在漏斗收口處放入一層薄薄的玻璃棉，并加入適量無水硫酸鈉，用5 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑沖洗干燥漏斗，備用。

硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:質(zhì)量濃度100 mg/L，含10種硝基苯酚的甲醇溶液，包括4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、2，4，6-三硝基苯酚、2，4，6-三硝基間苯二酚、2-甲基-4，6-二硝基苯酚、2-環(huán)己基-4，6-二硝基苯酚、3-甲基-4-硝基苯酚、3-甲基-2-硝基苯酚;質(zhì)量濃度100 mg/L的甲醇溶液?jiǎn)螛?biāo)。儲(chǔ)備液于4℃以下冷藏。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

取1.0 mL硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，得到質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，并根據(jù)需要稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于4℃以下冷藏。

1.3 色譜條件

柱溫35℃;流速1.5 mL/min;流動(dòng)相:溶劑A為乙腈(1%甲酸)，溶劑B為水(1%甲酸);A與B體積比1∶4的流動(dòng)相經(jīng)40 min線性變化至體積比1∶1，再經(jīng)10 min線性變化至A與B體積比4∶1的流動(dòng)相，最后調(diào)至A與B體積比1∶4的流動(dòng)相8 min平衡;色譜柱為 Waters XBridgeTMPhenyl柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);在進(jìn)行定量時(shí)，取各組分在最大吸收波長(zhǎng)(見表1)處譜圖積分。在上述色譜條件下，在316 nm波長(zhǎng)下的標(biāo)樣色譜圖見圖1。

表1 各目標(biāo)化合物紫外最大吸收波長(zhǎng)

1.4 樣品處理

對(duì)于含有機(jī)雜質(zhì)較多水樣，取1 000 mL水樣于2 000 mL分液漏斗中，加入60 g氯化鈉及適量氫氧化鈉，振搖溶解，調(diào)節(jié)水樣至pH＞13。再加入二氯甲烷與正己烷體積比1∶1的混合溶液150 mL，振搖，放氣，置于垂直振蕩器上，以220 r/min振搖15 min，靜止20 min以上至有機(jī)相和水相充分分離。棄去有機(jī)相，保留水相，水相即為凈化后的水樣。較干凈水樣可省去此凈化步驟。

先用5mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑預(yù)洗HLB柱，接著用10 mL甲醇分2次活化HLB柱，最后用10 mL水分2次活化HLB柱。向1 000 mL較干凈水樣或凈化后水樣中加入適量濃鹽酸，調(diào)節(jié)水樣至pH=2，加入10 g氯化鈉和10 mL甲醇，混勻后以5 mL/min的速度流過已經(jīng)活化好的HLB柱。用5 mL水沖洗HLB柱后，用高純氮?dú)獯礖LB柱至干燥。柱子干燥后，用5 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑浸泡HLB柱，浸泡15 min后，收集至收集瓶，再用二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑以1.5 mL/min的速度流過HLB柱，并收集至收集瓶中。洗脫液收集完畢后，用干燥漏斗進(jìn)行干燥，流出液收集至濃縮瓶中。再用3 mL二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑沖洗收集瓶，并將沖洗液過干燥漏斗進(jìn)行干燥，收集至濃縮瓶中，再用2 mL二氯甲烷與乙酸乙酯混合溶劑沖洗干燥漏斗，并收集至濃縮瓶中。用氮吹儀濃縮至0.5 mL，加入10 mL乙腈，再濃縮至1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣。

圖1 316 nm波長(zhǎng)下的標(biāo)樣色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化

實(shí)驗(yàn)中參考 EPA Method 3650B的方法［16］，利用酸堿分配理論來凈化廢水水樣中含有的可能會(huì)產(chǎn)生干擾的芳香族醛醚、多環(huán)芳烴等有機(jī)物［7］，利用酚類化合物在強(qiáng)堿性條件下以鹽類形式存在、而鹽類物質(zhì)在水中溶解度較大的原理來凈化水樣。

最初，嘗試使用C18和HLB固相萃取小柱來凈化水樣。將水樣調(diào)至pH＞13后，使其流過C18(HLB)固相萃取小柱以去除可能會(huì)產(chǎn)生干擾的有機(jī)物，收集流出的水樣，再將水樣 pH調(diào)至pH=2，再用C18(HLB)固相萃取小柱對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集，然后用溶劑洗脫目標(biāo)物。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取效率很差，尤其是相對(duì)分子質(zhì)量比較大的目標(biāo)化合物，損失率很高。因而考慮使用液液萃取的方式來凈化水樣，實(shí)驗(yàn)中選用二氯甲烷與正己烷體積比1∶1的混合溶劑作萃取劑來凈化水樣，能取得較滿意的效果。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

按照填料種類的不同，固相萃取柱可以分為鍵合硅膠、高分子聚合物、吸附型填料、混合型和專用柱系列等。其中，鍵合硅膠為固相萃取柱最常用的吸附劑，代表產(chǎn)品主要有C18、C8等;高分子聚合物是以極性官能化高分子樹脂為主體的新型反相固相萃取材料，它克服了傳統(tǒng)C18柱存在的缺點(diǎn)，提高了對(duì)極性化合物的保留能力以及重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)用Agilent Bond Elut C18柱(6 mL/500 mg)和 Waters Oasis HLB柱(6 L/150 g)進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。從圖2可見，在此實(shí)驗(yàn)條件下，HLB柱(6 L/150 g)的萃取效率優(yōu)于C18柱(6 mL/500 mg)的萃取效率。而且，HLB小柱的pH使用范圍為0～14，具有較強(qiáng)的酸堿耐受性。

圖2 Agilent Bond Elut C18柱和Waters Oasis HLB柱萃取效率對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.2.2 水樣pH對(duì)萃取效率的影響

硝基苯酚類化合物含有酚羥基，在水中容易電離，以離子狀態(tài)存在，會(huì)對(duì)固相萃取柱的萃取效率產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)對(duì)不同pH下的HLB小柱的萃取效率進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖3。從圖3可見，當(dāng)pH≤2時(shí)，HLB固相萃取柱的萃取效率能達(dá)到較滿意效果，所以實(shí)驗(yàn)中將水樣調(diào)至pH=2，再進(jìn)行目標(biāo)化合物的富集，以提高HLB萃取柱對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率。

2.2.3 洗脫劑的選擇

選定固相萃取柱后，根據(jù)固相萃取柱和目標(biāo)物質(zhì)的極性，需要選擇與之相配的洗脫劑。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇、二氯甲烷、二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作為洗脫劑的洗脫效率。從圖4可見，用二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作洗脫劑時(shí)的萃取效率明顯優(yōu)于用甲醇、二氯甲烷做洗脫劑時(shí)的萃取效率。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑作為洗脫劑。

圖3 pH吸附效率曲線

圖4 3種洗脫劑萃取效率比較

2.2.4 洗脫劑使用劑量的選擇

考慮到濃縮時(shí)間及對(duì)環(huán)境的影響，在保證回收率的前提下，洗脫劑使用劑量應(yīng)該盡可能的少。在確定好洗脫劑后，又對(duì)二氯甲烷與乙酸乙酯體積比1∶2的混合溶劑的使用劑量進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，在使用劑量達(dá)到10 mL后，洗脫劑的洗脫效率趨于穩(wěn)定。最終確定洗脫劑的使用量為10 mL。

圖5 淋洗曲線

2.3 方法性能指標(biāo)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取一定量硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)使用液于甲醇溶劑中，制備8個(gè)濃度點(diǎn)的校準(zhǔn)系列，進(jìn)樣量為10 μL。10種硝基苯酚類目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)見表2。

2.3.2 方法檢出限及測(cè)定下限

以實(shí)驗(yàn)室超純水為空白樣品，配制成目標(biāo)物濃度為預(yù)計(jì)方法檢出限2～5倍(0.3～0.6 μg/L，1 000 mL水樣)的加標(biāo)樣品。按照樣品分析的全步驟處理(凈化、富集、濃縮)，進(jìn)樣量為10 μL。平行測(cè)定7個(gè)加標(biāo)樣。按照HJ 168—2010的要求計(jì)算方法檢出限和測(cè)定下限，結(jié)果見表2。

表2 硝基苯酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及方法檢出限和測(cè)定下限

2.3.3 加標(biāo)回收率及精密度

根據(jù)HJ 168—2010的要求，測(cè)定了空白水樣加標(biāo)高質(zhì)量濃度(4.0～6.0 μg/L)、中質(zhì)量濃度(2.0～3.0 μg/L)、低質(zhì)量濃度(0.5～0.8 μg/L)3種情況下的精密度和加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 空白及實(shí)際水樣精密度及準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果 %

采集了某制藥廠的廢水水樣，按第1.4節(jié)的步驟對(duì)樣品進(jìn)行處理，并未檢測(cè)出硝基苯酚類化合物。并用該水樣測(cè)定了實(shí)際水樣加標(biāo)高質(zhì)量濃度(4.0 ～7.0 μg/L)、中質(zhì)量濃度(2.0 ～3.5 μg/L)、低質(zhì)量濃度(0.5～1.2 μg/L)3種情況的精密度和加標(biāo)回收率。實(shí)際水樣加標(biāo)后經(jīng)凈化步驟去除芳香族醛醚、多環(huán)芳烴等可能會(huì)產(chǎn)生干擾的有機(jī)物，再對(duì)凈化后的加標(biāo)水樣進(jìn)行富集濃縮測(cè)定，然后計(jì)算得到實(shí)際水樣的精密度和加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

2.4 實(shí)際水樣的測(cè)定

采集了某石油化工企業(yè)的廢水水樣，按照第1.4節(jié)的步驟對(duì)水樣凈化后進(jìn)行富集濃縮，測(cè)得水樣中含有 0.5 μg/L 的鄰硝基苯酚、0.8 μg/L的 2，4，6-三硝基間苯二酚、1.1 μg/L 的 2，4，6-三硝基苯酚、0.6 μg/L 的 4，6-二硝基鄰甲酚。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)建立了以固相萃取為前處理?xiàng)l件，液相色譜法測(cè)定水中10種硝基苯酚類化合物的分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證。該方法具有較高靈敏度，操作簡(jiǎn)便，空白水樣和實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果均在較滿意范圍內(nèi)。該方法適用于水中硝基苯酚類化合物的測(cè)定。

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