重組金黃色葡萄球菌腸毒素B對禽流感滅活苗的佐劑作用研究

周曉芬等

摘要：利用大腸桿菌的原核表達體系高效表達SEB基因，獲得了SEB重組蛋白（rSEB）；通過優(yōu)化SEB較好發(fā)揮免疫效果時的免疫劑量，選取5 μg/只SEB分別協同AIV-H9/NDV二聯滅活苗和AIV-H5滅活疫苗對2周齡的艾維因肉雞進行免疫，定期測定HA抗體滴度及淋巴細胞活性以評價SEB的免疫增強效果。結果表明，SEB免疫組的NDV和AIV的HA抗體效價顯著高于疫苗對照組（P<0.05），rSEB中劑量組（5 μg/只）佐劑效果明顯（P<0.05）；SEB協同免疫組的淋巴細胞活性在免疫后第15 天達到峰值，隨后逐漸下降，至第25天與疫苗對照組相比，差異仍然顯著（P<0.05）。

關鍵詞：SEB；佐劑；疫苗；肉雞

中圖分類號：R378.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4245-05

金黃色葡萄球菌產生的耐熱性腸毒素B（Staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB），是引起人類食物中毒和葡萄球菌胃腸炎的常見原因，因此，這方面的研究已成為科學家們普遍關注的重要課題。然而，作為一種超抗原，SEB具有強大的淋巴細胞絲裂原潛力，只需極低濃度（0.1 ng/mL）即可刺激強烈的免疫應答，不僅活化大量的T淋巴細胞，同時釋放眾多細胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α），而且可非特異性提高特異性抗原的免疫原性[1-4]。因此，SEB具備成為免疫佐劑的潛力。有研究發(fā)現，SEB不僅能增強B16F10 黑色素瘤弱抗原的免疫原活性，其效率可達25倍以上，而且免疫小鼠的保護率高達75%以上，保護期長達170 d以上[5]；而且SEB對T細胞依賴抗原BSA和HIV-gp120和Ⅱ型T細胞非依賴抗原——肺炎球菌脂多糖具有非特異性免疫增強作用[6]。在野生型小鼠中，鼻腔內給予OVA+SEB能誘導肺部炎癥，重要表現之一是OVA特異性IgE增加[7]。盡管SEB的佐劑活性在醫(yī)學領域有一定的認識，但目前在國際獸醫(yī)領域涉足極少，需要做大量的工作。本研究通過動物試驗首次研究rSEB作為禽流感疫苗免疫增強劑，通過檢測免疫雞群血清中HA抗體水平和外周血淋巴細胞增殖能力，以此評價SEB作為免疫佐劑的效果，為進一步深入開發(fā)利用SEB潛力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

表達菌株pET28a-SEB由本實驗室保存。1日齡非免疫艾維因肉雞購自武漢正大有限公司， 飼養(yǎng)至2周齡進行隨機分組隔離飼養(yǎng)管理；禽流感H9+NDV二聯滅活苗和H5滅活疫苗為黑龍江省生物制品一廠生產；AIV和NDV血凝素抗原從哈爾濱獸藥研究所購買；標準SEB（sSEB）及其陽性血清購自中國軍事醫(yī)學科學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 pET28a-SEB表達質粒的鑒定與表達 將表達pET28a-SEB的DH5α菌株，于37 ℃培養(yǎng)過夜后，提取質粒DNA，用BamH I和XholI酶切，并將表達菌株送上海生物工程公司測序。取測序正確的pET28a-SEB質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），涂布含Amp的LB平板37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)物A600 nm為0.6～0.8時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，收集菌體。經超聲波破碎后，離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。Western Blot檢測時，一抗為1∶1 000的SEB陽性血清，二抗為1∶5 000兔抗鼠IgG-HRP，顯色為TMB。

1.2.2 pET28a-SEB 包涵體的變性和復性及純化參考文獻[4]。純化蛋白質樣品用紫外分光光度計測定OD260 nm和OD280 nm值，蛋白質含量計算：蛋白質濃度（mg/mL）=（1.45×A280 nm-0.74×A260 nm）×稀釋倍數。將純化物分裝凍干保存，以備動物試驗。

1.2.3 動物試驗

1.2.3.1 SEB佐劑效應試驗 將105只14日齡肉雞隨機分成7組，每組15只。第1組到第5組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只，同時腹腔注射不同劑量的SEB，其中sSEB試驗組設高、中和低3個劑量，分別為1.0 μg/只、10 ng/只和1.0 ng/只；rSEB試驗組設置2個劑量，分別為1.0 μg/只和10 ng/只；第6組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只同時腹腔注射生理鹽水；第7組設為空白對照組。

1.2.3.2 rSEB較優(yōu)劑量選擇試驗 將90只14日齡肉雞隨機分成6組，15只/組，前5組肌肉注射AIV-H9/NDV滅活疫苗0.3 mL/只，第6組為空白對照組。其中第1組到第4組同時腹腔注射不同劑量的SEB，其中sSEB試驗組每只注射1.0 μg標準SEB；rSEB試驗組設置高、中、低3個劑量組，劑量分別為10.0 μg/只，5.0 μg/只和1.0 μg/只；第5組注射生理鹽水；第6組為空白對照組。

1.2.3.3 rSEB增強AIV-H5滅活疫苗免疫效果 將60只14日齡艾維因肉雞隨機分成4組，15只/組。第1至3組肌肉注射AIV-H5滅活疫苗0.3 mL，同時分別腹腔注射生理鹽水、5.0 μg/只rSEB和pET-28a轉化大腸桿菌裂解物上清液，第4組注射生理鹽水0.3 mL/只為空白對照組。

1.2.3.4 試驗動物處理 各試驗組在免疫后每天定時觀察活動狀態(tài)，在免疫后第7、14、21和28天翅靜脈采血，進行HI試驗測定HA抗體水平；同時分別收集免疫后第3、5、10、15、20和25天血液淋巴細胞進行MTT試驗[8]，測定淋巴細胞增殖。

1.2.4 統計學處理 數據處理測定結果以平均數和標準差表示，用t檢驗分析試驗組和對照組、差異的顯著性，并做相關性分析。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 pET8a-SEB的鑒定

由圖1可知，pET28a-SEB經BamHI和XholI 雙酶切后，得到大小為750 bp左右的目的片段。核苷酸測序結果，目的片段大小為720 bp，與PM36株的SEB基因核苷酸序列同源性達100%。

2.2 表達產物SDS-PAGE 和Western Blot檢測

SDS-PAGE結果顯示，轉化pET28a-SEB質粒的BL21（DE3）經IPITG誘導后成功地表達seb基因，重組蛋白分子量約為31 kDa，與預期結果一致。重組蛋白主要以包涵體形式存在，其表達量占沉淀總蛋白42%左右（圖2）；未經IPTG誘導的菌未出現明顯的目的蛋白質條帶；而轉化pET28a質粒的BL21（DE3）無特異條帶。Western Blot結果顯示，在約31kDa處出現一條特異性反應條帶（圖3），說明純化復性后的rSEB包涵體蛋白質能夠被SEB陽性血清識別，其抗原性良好。

2.3 SEB佐劑效應試驗

各試驗組內的雞群在免疫前后的采食、活動及精神狀態(tài)沒有明顯變化。對雞群定期采集血清和分離血液淋巴細胞，分別進行HI和MTT試驗，以評價肉雞的體液免疫和細胞免疫狀態(tài)。表1、表2和表3顯示，sSEB或rSEB免疫組的二者指標與免疫劑量呈正相關，與疫苗對照組和空白對照組的結果相比較，差異顯著（P<0.05）；其中疫苗+1.0 μg/只sSEB組具有顯著的免疫增強作用，與其他各組差異顯著（P<0.05）；sSEB免疫增強作用比同等劑量的rSEB的作用強。

2.4 rSEB佐劑劑量選擇試驗

由表4、表5和表6數據顯示，5 μg/只rSEB組在免疫第2周后的抗體水平和淋巴細胞活性比其他各組同期的結果都高，而一定劑量sSEB的佐劑作用顯著高于同等劑量rSEB的佐劑效果（P<0.05）；高劑量rSEB（10.0 μg/只）在免疫初期1～2周的HA抗體滴度和淋巴細胞活性快速提高，但隨后無明顯變化，低于其他各試驗組。

2.5 rSEB增強AIV（H5）滅活疫苗免疫效果

在整個試驗過程中，以rSEB+AIV（H5）滅活疫苗免疫組的抗體效價比AIV（H5）滅活疫苗免疫組的抗體效價高，二者差異顯著（P<0.05）；AIV（H5）滅活疫苗和PET-28a轉化大腸桿菌裂解物免疫組與疫苗免疫組抗體效價效價相當，無明顯差異（表7）。這進一步說明，SEB在與其他疫苗抗原同時使用時起到了免疫增強作用。

3 討論

SEB具有多種生物學功能[9]，但基于生物安全和食物中毒潛在風險，SEB的實際應用多受限制，尤其是在獸醫(yī)應用領域鮮見報道。許多研究發(fā)現，SEB具有雙相激活作用的機制，即高劑量時誘導迅速，隨之出現反應不應期，而在低劑量時，則誘導長期而持續(xù)的激活狀態(tài)[10，11]。在本研究的過程中，發(fā)現合適的劑量0.01～10 μg rSEB均具有佐劑效應，然而過高劑量的SEB（>10 μg/只）引起了一定程度的免疫抑制。這一現象與其他研究者的結果基本一致。俞紅等[12]用純化的重組SEB蛋白進行小鼠脾細胞淋轉試驗證明，10 μg/mL濃度的SEB刺激淋轉的能力最大；當濃度達20 μg/mL或以上時，淋轉受到抑制，且濃度越高，抑制越嚴重。魏萍[13]研究了SAg-SEB和MDV誘導雛雞與荷瘤小鼠免疫學變化及細胞凋亡情況，結果也顯示SEB存在雙向激活作用。SEB的雙相作用存在暴露劑量的依賴關系，可能原因是SAg刺激T細胞數量有一閾值存在。

雖然在整個動物試驗過程并未發(fā)現0.01～10 μg的SEB對雞群造成肉眼可見病變，但SEB帶來的生物安全性問題不容忽視。國外早期的研究表明，小鼠給予SEB后導致毒素體內分布的峰值出現于1 h之后，至24 h后毒素消失；即使給予BALB/c小鼠SEB100 μg/只，3～4 d后小鼠會開始恢復健康[14]。這說明SEB在動物體內停留的時間不長，能被快速代謝而降解。盡管還不清楚SEB在肉雞體內的代謝規(guī)律，但是有研究者曾研究金黃色葡萄球菌超抗原家屬另一成員SEA在肉雞體內的代謝規(guī)律，研究結果表明肌肉注射200 μg rSEA甚至更高劑量后肉雞并沒出現明顯異常表現，7 d后檢測不到SEA殘留[15]。而且關于SEB對雞體的病理損害，國內已有報道[16]，但其涉及SEB劑量為50 μg/只標準SEB，這一劑量是本試驗劑量的10倍以上。將為下一步進行SEB對雞體的毒理和病理試驗提供了借鑒。同時借助SEB-ELISA檢測試劑進一步了解SEB在雞體內的代謝動力學規(guī)律和安全劑量，為安全利用SEB奠定基礎。此外，本試驗對SEB結構進行合理改造，減少甚至消除其毒副作用，充分發(fā)揮其超抗原優(yōu)勢，促進其在獸醫(yī)科學上應用領域。

試驗結果表明，適量SEB具有良好的佐劑活性，不僅能協助禽流感和新城疫等免疫抗原誘導機體產生快且強的體液免疫，同時也能激活細胞免疫，進而增強雞體抗病能力。適量rSEB作為強有力的T細胞激活抗原，具有強大的佐劑潛力，如能合理利用其超抗原優(yōu)勢，SEB在預防獸醫(yī)領域將具有重要的開發(fā)應用價值。

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